克拉瑪依果樹腐爛病病原菌鑒定及其拮抗菌的篩選

牛春林，葉曉蕓，艾 尼，王振華，熱依汗，姜國勇，高 雁，宋素琴，楚 敏

(1.新疆石油管理局造林減排作業(yè)區(qū)，新疆克拉瑪依　834000；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊　830091)

0　引 言

【研究意義】近10余年來，在國家實施西部大開發(fā)戰(zhàn)略和新疆產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整下，新疆特色林果種植飛速發(fā)展，林果業(yè)已成為新疆農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收的重要手段[1,2]。但隨著種植面積的增加，加之田間日常管理和水肥管理的不足，以及近年來氣候因素等，果樹腐爛病發(fā)病嚴重，已造成果樹枯死，果園減產(chǎn)，嚴重的造成毀園，制約了新疆特色林果業(yè)的發(fā)展[3]。因此，研究果樹的腐爛病病原及篩選相關(guān)生防菌劑對高效生物防治該病具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】 果樹腐爛病又名爛皮病，主要危害枝干, 致使皮層腐爛壞死，常表現(xiàn)為潰瘍型和枝枯型兩種類型。果樹腐爛病因其分布廣、難治愈、高復(fù)發(fā)等特點，是果樹生產(chǎn)中重要的病害之一[4,5]。目前，新疆主要特色林果如蘋果、香梨、桃樹、核桃等果樹均有不同程度的發(fā)病[6-10]。研究表明，果樹腐爛病主要由殼囊孢菌Cytospora屬(有性型為蘋果黑腐皮殼菌Valsa屬)引起，我國目前已知相關(guān)病原菌共涉及該屬下6個種[11]?！颈狙芯壳腥朦c】在現(xiàn)有報道中，新疆蘋果樹腐爛病致病菌有C.chrysosperma、C.mali、C.schulzeri和C.leucostoma引起，但存在著區(qū)域分布不迥，而有關(guān)李子樹腐爛病，此前國內(nèi)尚無報道。研究通過形態(tài)學、生理生化特性及分子生物學方法確定蘋果樹與李子樹病原菌的分類地位；采用組織分離法和平板對峙法篩選得到拮抗效果較好的拮抗菌。【擬解決的關(guān)鍵問題】以新疆克拉瑪依綠城實業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)蘋果樹和李子樹腐爛病為研究對象，對其致病菌進行分離鑒定，并開展其相關(guān)拮抗菌的篩選，為新疆果樹腐爛病病原多樣性和開展相關(guān)生物防治提供科學依據(jù)和奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材 料

1.1.1腐爛病樣本

蘋果樹和李子樹腐爛病樣本采集自新疆克拉瑪依綠城實業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)。

1.1.2土樣采集

用于拮抗菌分離的土樣采集于生態(tài)果園內(nèi)果樹根部地下5～20 cm土壤。

1.1.3篩選培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，磷酸氫二鉀 3.0 g，葡萄糖1.0 g，瓊脂15 g/L，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

其它常見培養(yǎng)基：馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，高氏一號培養(yǎng)基(Gause' s No.1)。

1.2　方 法

1.2.1病原菌分離

取蘋果樹和李子樹腐爛病樣本枝條，在無菌工作臺中，先用75%的酒精消毒30 s，其次1.2% NaClO消毒3 min，然后用無菌蒸餾水清洗3次進行表面消毒，放在無菌濾紙上晾干。 切取5 mm×5 mm左右具有典型腐爛病病征的組織塊，移至準備好的PDA(含氯霉素)培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)，并觀察菌落長出后挑取邊緣菌絲，進行菌種純化和保藏[12]。

1.2.2拮抗菌分離

拮抗菌的分離采用雙層平板法進行分離篩選。為了篩選快速生長并產(chǎn)生拮抗作用的菌株，采用黑曲霉作為指示菌，孢子懸液控制在104～105CFU/mL，取0.2 mL均勻涂布于下層PDA培養(yǎng)基上，待懸液被培養(yǎng)基吸收后，倒入45℃左右的完全培養(yǎng)基或高氏培養(yǎng)基，待其凝固后備用[13,14]。

無菌條件下稱取土樣5 g， 置于裝有50 mL 0.85 %生理鹽水三角瓶中(裝有無菌玻璃珠)，30℃ 條件下 120 r/min 振蕩 0.5 h，靜置。壤懸液經(jīng)梯度稀釋后，吸取0.2 mL涂布至上述平板上，于 30℃ 恒溫培養(yǎng)，并觀察菌落生長和抑菌情況，挑選具有明顯抑菌圈，菌株菌落形態(tài)、大小及顏色不同菌落，進行分離純化后，斜面4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3拮抗菌復(fù)篩

拮抗菌株的復(fù)篩采用平板對峙法進行。以分離到的蘋果樹和李子樹腐爛病病原為指示菌。首先，將病原菌接種于PDA 平板進行活化，30℃下培養(yǎng)至病原菌長滿平板，用滅過菌的0.5 cm打孔器對病原菌打孔制成菌餅。然后，接種菌餅于PDA平板中心，采用四點對峙法將拮抗，每處理重復(fù)3次，并以未接拮抗菌的病原菌為對照，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d后，觀察并測定抑菌效果[10,15]。

1.2.4菌株的分子生物學鑒定

病原真菌ITS 序列采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’， ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進行ITS序列PCR擴增。細菌16S rDNA序列采用通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行16S rDNA 的PCR擴增。

PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化回收后，送往北京鼎國生物技術(shù)有限公司進行測序，所測得序列人工校正后，真菌序列在http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/DefaultInfo.aspx數(shù)據(jù)庫上進行比對，細菌序列在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)數(shù)據(jù)庫上進行比對，并分別調(diào)取同源性最高模式菌株及相關(guān)菌株序列, 使用MEGA5.0進行CLUSTAL X多重比對，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[16]，自舉值(Bootstrap) 為1 000。

2　結(jié)果與分析

2.1　腐爛病病原菌的分離與鑒定

2.1.1腐爛病原菌分離與純化

經(jīng)分離純化，分別從蘋果樹和李子樹腐爛病病害典型樣本中，分離得到真菌菌株5株，通過平板生長情況及菌落形態(tài)學特征分析，初步確定菌株可分為兩類，其中編號PF1、PF2、LF1為第一類，菌絲生長迅速，菌落初期為白色，羽毛狀擴展，中間部位氣生菌絲明顯，棉絮狀，之后逐漸變?yōu)榛野咨＜s4 d長滿平板。后期菌絲體逐漸變?yōu)榛野字梁诤稚?，并分泌灰黑?圖1)；編號LF2、LF3為另一類，菌絲生長迅速，菌落初期為白色，羽毛狀擴展，中間部位氣生菌絲明顯，棉絮狀，之后逐漸變?yōu)榛野咨?。約4 d長滿平板。后期菌絲體逐漸變?yōu)榛野字梁诤稚⒎置诨液谏?圖2)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病僅涉及第一類，而李子樹腐爛病兩類均有發(fā)現(xiàn)。圖1，圖2

2.1.2病原菌分子鑒定

所得菌株分別利用真菌ITS 序列通用引物進行PCR擴增，獲得長度約為600 bp 的PCR產(chǎn)物，通過進一步序列測定和校正后，分別在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)及http://www.westerdijkinstitute.nl/ Collections/DefaultInfo.aspx數(shù)據(jù)庫上進行比對。通過在線比對，發(fā)現(xiàn)所得菌株均與Valsa屬。進一步系統(tǒng)進化樹構(gòu)建表明，菌株P(guān)F1、PF2、LF1與ValsamaliTY121同源性為100%；菌株LF2和LF3與ValsaleucostomaBJFU SXLM1064同源性為100%，初步確定研究所得腐爛病病原菌為Valsamali和Valsaleucostoma，其中蘋果樹腐爛病病原菌僅為Valsamali，而李子樹腐爛病病原菌兩者均有。圖3

圖1PF1,PF2,LF1菌落形態(tài)
Fig.1Colony morphology of PF1,PF2 and LF1

圖2LF2,LF3菌落形態(tài)
Fig.2Colony morphology of LF2 and LF3

圖3基于真菌ITS序列建立的病原菌NJ系統(tǒng)進化樹
Fig.3NJphylogenetictreeofpathogenicfungibasedon16SrDNAsequence

2.2　拮抗菌的分離和鑒定

以黑曲霉為指示菌，采用雙層平板法，對采集的生態(tài)果園內(nèi)果林根部土壤開展了拮抗菌的分離篩選。通過樣品稀釋涂布，菌種的分離，共獲的對黑曲霉具有拮抗作用的菌株15株，其中細菌10株，放線菌5株。

15株菌株16S rDNA序列經(jīng)PCR擴增和測序，所得序列提交至 EzTaxon 數(shù)據(jù)庫(http://www.ezbiocloud.net/identify)進行相似度比較，同時分別調(diào)取各菌株同源性最高模式菌株序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹。所得菌株分別歸屬于鏈霉屬、諾卡氏菌屬、類芽孢菌屬及芽孢菌屬，總計4個屬9個種，其中芽孢菌屬涉及種類最多，共5個種；其次鏈霉屬，涉及2個種。圖4

圖4基于16S rDNA序列建立的拮抗菌NJ系統(tǒng)進化樹
Fig.4NJ phylogenetic tree of antagonistic bacterium based on 16S rDNA sequence

2.3　果樹腐爛病原菌拮抗菌的復(fù)篩

果樹腐爛病病原菌拮抗菌的復(fù)篩采用平板對峙法進行。以分離到的蘋果樹和李子樹腐爛病病原菌PF1和LF2為指示菌。先將病原菌菌餅接種至PDA平板中心，采用四點對峙法進行拮抗菌的復(fù)篩，研究表明，所分離的拮抗菌對PF1和LF2抑制效果存在著區(qū)別，但總體差別不大。鏈霉菌A1和芽孢桿菌B4、B6對所得的腐爛病病原菌具有較好的抑制的效果，抑菌圈菌落比最大分別可以達到1.95、2.11和2.79。圖5

進一步對菌株芽孢桿菌B4和B6對腐爛病抑制效果分析發(fā)現(xiàn)，盡管兩株菌均具有較好的抑菌效果，但兩者對病原菌的抑菌圈形狀不同，病原菌受菌株B4抑制時，抑菌圈邊緣較為整齊，真菌基絲和氣生菌絲基本在一個垂面，且受抑制處邊緣明顯有大量真菌孢子產(chǎn)生。而病原菌受B6抑制時，抑菌圈邊緣不整齊，真菌氣生菌絲比基絲明顯受抑制，菌絲體由內(nèi)至邊緣逐漸變薄，同時在兩株菌的相互作用的過程中，在菌株B6菌落周圍形成了一個明顯的暈圈，相關(guān)不同的抑制機理還有待進一步研究。圖6

圖5拮抗菌對果樹腐爛病病原菌抑菌活性
Fig.5Antagonistic activity of bacterium against to the pathogen of fruit tree canker

注：A:芽孢桿菌B4和 B6對Valsamali的拮抗平板; B:芽孢桿菌B6抑菌圈邊緣特征;C:芽孢桿菌B4抑菌圈特征;D:Valsamali受芽孢桿菌B6拮抗抑菌圈邊緣菌絲顯微特征；E:Valsamali受芽孢桿菌B4拮抗抑菌圈邊緣菌絲顯微特征

Note:A: Antagonistic plates of Bacillus B4 and B6 againstValsaMali; B: Edge characteristics of the inhibition zone by B6;C: Edge characteristics of the inhibition zone by B6;D: Microscopic characteristics of the edge mycelia ofValsaMaliaround inhibition zone by B6;E: Microscopic characteristics of the edge mycelia ofValsaMaliaround inhibition zone by B4

圖6芽孢桿菌B4和B6對Valsa mali抑制效果
Fig.6Inhibitory effect of B4 and B6 against Valsa mali

3　討 論

腐爛病作為我國北方林果樹木的常見病害之一，涉及林木種類多，發(fā)病區(qū)域廣泛，最南至江蘇徐淮地區(qū)均發(fā)現(xiàn)腐爛病的發(fā)生[17]。已在常見林果樹木如蘋果樹、梨樹、楊梅樹、紅棗樹、核桃樹、楊樹、榆樹、國槐樹、胡楊樹等樹木均發(fā)現(xiàn)有腐爛病的發(fā)生[18]。相關(guān)研究表明，上述腐爛病的主要病原菌為由殼囊孢菌Cytospora屬(有性型為腐皮殼菌Valsa屬)引起，我國目前已知相關(guān)病原菌共涉及該屬C.mali、C、malicola、C.chrysosperma、C.schuzeri、C.atrocirrhata和C、persoonii(C.leucostoma)等5個種，而相同種間亦存在致病力差異。

目前，新疆林果是我國腐爛病發(fā)病主要地區(qū)之一，主要栽培果樹中均發(fā)現(xiàn)腐爛病。相關(guān)研究證明我區(qū)的果樹腐爛病存在著多種病原菌，郭開發(fā)等[8]對新疆南疆核桃樹腐爛病菌進行了分子學鑒定，確定其致病菌為金黃殼囊孢C.chrysosperma。唐俊煜等[9]對庫爾勒香梨樹腐爛病菌生物學特性與致病性的初步研究發(fā)現(xiàn)，其致病菌為金黃殼囊孢C.chrysosperma。劉應(yīng)敏等[10]對新疆蘋果樹腐爛病病原菌的分離、鑒定及其生物學特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株C能夠在新疆蘋果樹上造成危害。新疆林果業(yè)主要布局在南疆地區(qū)，目前對北疆地區(qū)果樹腐爛病的研究較少。

研究針對新疆克拉瑪依綠城實業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)蘋果樹和李子樹腐爛病的病原菌進行了篩選鑒定，確定蘋果樹腐爛病病原菌為Valsamali，李子樹腐爛病病原菌分別包括Valsamali和Valsaleucostoma。該研究不僅進一步證明了新疆果樹腐爛病病原菌存在著多樣性，也在國內(nèi)首次報道了李子樹腐爛病病原菌，相關(guān)研究對新疆腐爛病研究具有明顯的指導(dǎo)意義。同時，研究篩選獲得了多株具有不同效果的拮抗菌，為我區(qū)果樹腐爛病的生物防治替代了科學依據(jù)和材料。

4　結(jié) 論

新疆克拉瑪依綠城實業(yè)有限公司生態(tài)果園內(nèi)蘋果樹和李子樹腐爛病的病原菌初步確定蘋果樹腐爛病病原菌為Valsamali，李子樹腐爛病病原菌分別包括Valsamali和Valsaleucostoma。

所得各類拮抗真菌菌株15株，分別歸屬于鏈霉屬、諾卡氏菌屬、類芽孢菌屬及芽孢菌屬，總計4個屬9個種，其中芽孢菌屬涉及種類最多，共5個種；其次鏈霉屬，涉及2個種。

篩選到高效拮抗細菌2株，芽孢桿菌B4和B6對腐爛病具有較好抑菌效果，其最大抑菌圈菌落比可分別達到2.11和2.79，但兩者對病原菌的抑菌圈形狀不同。

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