交叉引物恒溫擴增技術在副溶血性弧菌毒力基因檢測中的應用

吳曉芳　紀蕾　嚴偉　黃世旺　馬學軍

313000 湖州市疾病預防控制中心微生物檢驗科(吳曉芳、紀蕾、 嚴偉)；310000 杭州市江干區疾病預防控制中心檢驗科(黃世旺)；102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所(馬學軍)

副溶血性弧菌 (vibrio parahaemolyticus，VP)是一種分布極為廣泛的嗜鹽性致病菌[1]。我國南方沿海地區每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的報道,已成為最嚴重的食源性病原菌[2]。

副溶血性弧菌致病性是由其產生的毒力因子決定的。即不耐熱溶血素(TLH)、耐熱直接溶血素(TDH)和耐熱直接相關溶血素(TRH)[3]。TLH 基因具有種屬特異性，無論是臨床還是環境分離的副溶血性弧菌均攜帶TLH 基因[4]；而副溶血性弧菌臨床分離株通常攜帶TDH或TLH毒力基因[5]。

副溶血性弧菌常規的細菌培養方法操作繁瑣費時，很難實現快速檢測的要求。近年來很多分子生物學技術在VP的檢測中發揮了很大的作用。但分子生物學方法都需要配備昂貴的儀器，且技術要求高，不利于現場、基層單位的使用。交叉引物恒溫擴增技術(cross priming amplification，CPA)是一項全新的恒溫擴增檢測技術[6]，與LAMP、NASBA等被廣泛應用于各種病原的快速檢測[7]。目前，CPA技術已成功應用到細菌和病毒的核酸檢測中，如志賀氏菌和甲型H1N1流感病毒[8-9]。本研究采用交叉引物恒溫擴增-核酸檢測裝置，建立了快速檢測副溶血性弧菌TLH、TDH的方法。現將結果報道如下：

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1菌株來源:副溶血性弧菌參考菌株ATCC 17802(TLH+)ATCC33847(TLH+和TDH+)由浙江省疾控中心提供；本實驗室從水產品和臨床腹瀉患者標本中分離保存的副溶血性弧菌共464株(水產品128株，臨床標本336株)；其他致病菌16株由浙江省疾控中心提供(嗜水氣單胞菌 ATCC 35654、類志賀鄰單胞菌 ATCC 14029、非O1群霍亂弧菌 CMCC 04819、溶藻弧菌 ATCC 17749、創傷弧菌 ATCC 27562、大腸埃希氏菌 ATCC 25299、鼠傷寒沙門氏菌 ATCC 50013、阪崎腸桿菌 ATCC 29544、奇異變形桿菌 CMCC 49005、產氣腸桿菌 CMCC 45103、福氏志賀菌2b型 ATCC 12202、肺炎克雷伯菌 ATCC 13883、金黃色葡萄球菌 ATCC 25923、蠟樣芽孢桿菌 ATCC 14579、單核細胞增生李斯特菌 ATCC 54002、銅綠假單胞菌 ATCC 27853)。

1.1.2主要試劑:全封閉核酸檢測裝置購置杭州優思達生物技術有限公司(生產批號：20160920-34)，副溶血性弧菌TRH、TDH、TLH 三重熒光PCR法檢測試劑盒由深圳生科原生物股份有限公司提供(生產批號：17020907)。DNA提取試劑盒由北京卓誠惠生生物科技股份有限公司提供(生產批號：20160118)。

1.1.3主要儀器:ABI 7500型熒光定量PCR儀購置美國ABI公司，恒溫金屬浴購置杭州博日科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1引物和探針:根據TLH、TDH保守序列設計VP-CPA引物、探針，引物設計參考文獻[10-11]。引物、探針委托大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.2菌落計數:以無菌操作分別將副溶血性弧菌參考菌株培養液1 ml按10倍遞增稀釋至10-1～10-6濃度，并選擇10-3、10-4、10-53個稀釋度各0.2 ml 接種平板，同一稀釋度做三個平行，37 ℃培養24 h后計數平板上可見菌落數，即可推算出原液中所含的細菌數。

1.2.3模板DNA的制備:取各類菌株分別接種選擇性平板，37 ℃培養18 h，取純菌落用DNA提取試劑盒提取模板。-20 ℃ 保存備用。

1.2.4CPA反應體系和條件:反應體積為20 μl，通過調整反應溫度(56～64 ℃)、反應時間(20～70 min)等確定最佳的CPA-核酸檢測試紙條法的反應條件[12]。

1.2.5CPA擴增產物分析:將CPA擴增產物直接放入全封閉式靶核酸檢測裝置中，5～10 min后觀察結果：質控線(C)和檢測線(T)都出現紅線，結果為陽性；只在質控線(C)出現紅線，結果為陰性。見圖1。

圖1　全封閉式靶核酸檢測裝置使用說明及結果判斷Fig.1　Closed target nucleic acid detection device instructions

1.2.6特異性實驗:取水產品和臨床標本中分離的VP菌株以及其他致病菌菌株，采用CPA-核酸檢測試紙條法進行TLH、TDH 檢測，驗證特異性。

1.2.7靈敏性實驗:分別取上述10-1～10-6的菌懸液用DNA提取試劑盒提取模板。采用CPA-核酸檢測試紙條法和熒光定量PCR法同時進行TLH、TDH 檢測，評價反應體系的敏感性。

1.2.8重復性實驗:分別取上述10-1～10-6的菌懸液用DNA提取試劑盒提取模板，每個稀釋度平行重復3次，通過對各次實驗結果來評價反應體系的穩定性。

2　結果

2.1菌落計數選擇副溶血性弧菌參考菌株10-3、10-4、10-53個稀釋度的菌懸液，24 h培養后，可清晰觀察到平板上生長的菌落，經比較篩選，以10-3的3個平板上生長的平均菌落數分別是36和32來計算原菌液的細菌含量，經計算原菌液的細菌濃度為1.8×105cfu/ml和1.6×105cfu/ml。

2.2CPA方法檢測VPTLH、TDH最佳反應溫度檢測TLH、TDH 反應體系總體積20 μl，包括 Buffer 17 μl、混合酶 1 μl 以及DNA模板2 μl。取10-2～10-6的VP參考菌株菌懸液在不同反應溫度下擴增 40 min，結果顯示：最佳的反應溫度為60 ℃。

2.3CPA方法檢測VPTLH、TDH最佳反應時間取VP參考菌株菌懸液在60 ℃ 擴增條件下作用不同時間。結果顯示：最佳的反應時間為40 min。

2.4CPA方法檢測VPTLH、TDH的特異性CPA-核酸檢測試紙條法分別對水產品、臨床標本中分離的各10株VP菌株以及16株其他致病菌菌株進行TLH、TDH檢測。結果顯示：10株水產品中分離的VP菌株TLH陽性、TDH陰性；10株臨床標本分離的VP菌株TLH和TDH均陽性；16株其他致病菌菌株TLH和TDH均陰性。

P：陽性對照；N：陰性對照；1∶1.8×105；2∶1.8×104；3∶1.8×103；4∶1.8×102；5∶1.8×101；6∶1.8×100；7∶1.8×10-1 cfu/ml圖2　CPA方法檢測VP TLH 靈敏性P：positive control；N：negative control；1∶1.8×105；2∶1.8×104；3∶1.8×103；4∶1.8×102；5∶1.8×101；6∶1.8×100；7∶1.8×10-1 cfu/mlFig.2　Sensitivity of CPA method to detect VP TLH

P:陽性對照，N：陰性對照，1∶1.6×105；2∶1.6×104；3∶1.6×103；4∶1.6×102；5∶1.6×101；6∶1.6×100；7∶1.6×10-1 cfu/ml圖3　CPA方法檢測VP TDH 靈敏性P：positive control；N：negative control；1∶1.6×105；2∶1.6×104；3∶1.6×103； 4∶1.6×102；5∶1.6×101；6∶1.6×100；7∶1.6×10-1 cfu/mlFig.3　Sensitivity of CPA method to detect VP TDH

2.5CPA方法檢測VPTLH、TDH的靈敏性對10-1～10-6的VP參考菌株菌懸液進行TLH、TDH檢測。結果顯示：CPA-核酸檢測試紙條法檢測TLH、TDH的最低檢測限分別達到1.8 cfu/ml 和16.0 cfu/ml，和熒光定量PCR法結果完全一致。見圖2、3。對每個濃度的VP參考菌株菌懸液都作三次重復檢測, 檢測的結果均能判斷為陽性。

2.6CPA方法檢測不同樣本分離株TLH、TDH對464株不同來源的VP菌株用CPA-核酸檢測試紙條法和熒光定量PCR法同時進行TLH、TDH檢測，結果相符合。464株VP菌株TLH基因陽性率為100.00%(464/464)；水產品中分離的VP菌株TDH毒力基因陽性率為7.81%(10/128)；臨床標本分離的VP菌株TDH毒力基因陽性率為97.32%(327/336)。見表1。

2.7實際樣品檢測采集食源性疾病腹瀉標本85份，分別用Real-Time PCR方法和CPA法進行平行實驗，對比兩種方法的優劣性，進而評價CPA方法。實驗結果表明：應用CPA法檢出9份副溶血性弧菌TDH和TLH陽性，與Real-Time PCR方法檢測結果完全一致。

表 1　CPA-核酸檢測試紙條法檢測VP TLH、TDH結果

3　討論

副溶血性弧菌是引起急性胃腸炎的重要致病菌之一[13]。患者可出現腹痛、腹瀉、惡心等臨床癥狀。湖州市連續幾年的食源性疾病病例監測結果顯示，引起腹瀉癥狀的致病菌主要以副溶血性弧菌為主[14]。

副溶血性弧菌引起致病的主要原因是可產生TDH和TRH溶血毒素[3]，超過90%的VP臨床分離株攜帶TDH毒力基因，而環境分離株僅0%～6%攜帶TDH毒力基因[15]。而TRH很少在各類標本中檢出。因此建立副溶血性弧菌 TLH和TDH快速準確的檢測方法十分必要,對及時有效治療患者、控制事件蔓延具有重要意義。

CPA 方法是一種新穎的恒溫擴增方法，儀器設備簡單，只需能夠保持恒定的溫度即可。CPA擴增體系中主要包含具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶，還包括擴增引物和兩條交叉引物。這些寡聚核苷酸鏈能依靠Bst DNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使DNA的循環擴增能不斷的實現，從而達到基因擴增的效果。整個擴增及結果觀察可以在1 h內完成。由于其中一條特異性引物的5’末端標記了Biotin，特異性探針3’末端標記了FITC，擴增結束后的擴增產物分別與核酸檢測裝置中反應試劑條中的標記生物素結合鏈霉素共軛顏色顆粒以及測試線中的抗FITC抗體結合，測試結果顯示顏色，可在5 ～10 min肉眼觀察結果。更重要的是將擴增產物放在全封閉式核酸檢測裝置中，降低了由擴增產物引起的交叉污染[6]。本研究建立的副溶血性弧菌TLH、TDH CPA-核酸檢測試紙條方法靈敏度高，對菌株的最低檢測限達到1.8 cfu/ml 和16.0 cfu/ml；特異性好，與其他致病菌均沒有交叉反應。重復性實驗表明，CPA檢測方法穩定性好，且與熒光定量PCR方法檢測結果相符。

研究結果顯示，用CPA-核酸檢測試紙條法分別對464株不同來源的VP菌株進行TDH 檢測，陽性率分別為7.81%(水產品分離株)和97.32%(臨床分離株)，與熒光定量PCR方法檢測結果一致。

綜上所述, 本研究建立的VP-CPA快速檢測技術，是將高端的基因診斷技術轉化為操作簡單快捷、結果準確可靠的方法，無需特殊儀器設備, 實現了結果的可視化。另外，擴增產物放在一個全封閉的核酸檢測裝置中，完全避免了擴增產物的泄漏，產物間的交叉污染以及假陽性結果。因此非常適用于基層以及突發公共衛生事件的現場快速檢測。

利益沖突：無。

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