甲型肝炎病毒疫苗株H2株的連續傳代及其基因穩定性

王東寶　曹晗　鄭勇　史小軍　馬忠飛　段穎融　鄧燕　孫明波

650118 昆明，北京協和醫學院中國醫學科學院醫學生物學研究所 云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室

甲肝病毒(hepatitis A Virus)是一類能夠引起人類肝功能異常的小RNA病毒，由它導致的傳染病稱為甲型肝炎，此病傳播速度快，在所有肝炎中發病率最高，從90年代開始流行較為嚴重，導致數百萬人發病，給患者和國家造成極大和經濟負擔，影響較為嚴重。[1]。

1992年,中國醫學科學院醫學生物學研究所(以下簡稱：生物所)與浙江省醫學科學院、中國食品藥品檢定研究院三家單位共同合作,開發研制出甲型肝炎減毒活疫苗(H2株)，該疫苗是我國首創，成功地控制了甲肝流行，取得了顯著的社會效益及經濟效益[2-3]。目前生物所生產的甲肝疫苗采用的是甲肝病毒H2株[4]進行生產，此毒株于1982年分離自我國杭州市郊農村一名12歲男性甲肝患者的糞便，經原代猴腎細胞傳20代，人胚肺二倍體細胞KMB17傳5代獲得，經檢定合格，用于疫苗生產。由于毒株是HAV野毒株經體外細胞傳代適當減毒獲得，根據疫苗生產的相關要求，用于生產活疫苗的毒種，必須保持減毒株的特性，其致病性的毒力和免疫原性應相對穩定，毒力不應當隨著傳代發生“返祖”或降低，尤其是重要毒力相關位點不能夠發生重大突變。因此，在疫苗生產過程中，研究H2株毒種的遺傳基因是否發生較大變異，具有重大的意義。

以往對HAV病毒基因的研究[5-8]都是采用一代測序原理 (即sanger 測序)，進行部分片段或全基因組測序。這種直接測序方法具有高度的準確性和簡單、快捷等特點，但由于此種測序方法有一定的具局限性，不能夠全面反映出整個樣品中HAV全部基因組突變概率和真實變化情況。而第二代高通量測序的基本原理是邊合成邊測序，它能夠一次對幾百萬到幾億條DNA分子進行序列測定，具有高通量、超深度、高靈敏度并且速度快、準確率高、成本低和信息量豐富等優點，而且能夠全面地反映基因組上變異圖譜[9-10]。

我所學者己經采用第二代基因測序的方法,對脊髓灰質炎病毒進行了研究[11]，受此啟發，本試驗對甲肝病毒H2M20K7主代毒種、工作種子、疫苗代次及傳代后不同代次的病毒采用高通量測序(二代基因測序法)方法進行病毒的全基因序列測定，從分子水平對H2株不同代次病毒的基因穩定性和毒力基因位點變異率進行分析，以進一步考察H2株毒種在連續傳代過程中的遺傳穩定性和毒力特征, 也為疫苗株的選擇、制備和穩定性考察提供參考和借鑒。

1　材料與方法

1.1病毒及細胞甲肝病毒原始種子H2M20K5(K5)由浙江省醫學科學院提供，經生物所用KMB17細胞再傳代2次，獲得H2M20K7主代種子批(K7)，批號為201201。K7再經KMB17細胞連續傳代三次，建立了工作種子庫H2M20K10(K10)。KMB17細胞種子來源于生物所二室，是生物所于1972建立的人二倍體細胞株[12]，也是目前用于生產H2株減毒活疫苗的細胞，工作細胞代次為16代,批號為201501.

1.2主要試劑及儀器MEM培養基購自美國Gibico公司；新生牛血清購自蘭州民海生物；細胞培養液、細胞維持液、病毒稀釋液的其他成分均由本所提供；細胞培養容器為美國nunc細胞工廠；病毒RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Kit)為德國Qiagen公司提供；大容量高速離心機購自美國THERMO；超聲破碎儀購自美國 Thermo；洗板機：美國BioTek ELX50；酶標儀:美國BioTek SynergyHT；HAV-Ag檢測板:生物所生物制品九室提供。

1.3病毒連續傳代及樣品制備參照甲肝病毒生產工藝，取甲肝減毒活疫苗工作種子H2M20K10(K10)，經凍融超聲后，接種在培養成單層的KMB17細胞上(病毒接種MOI為0.1, 細胞代次為32代)，進行培養，培養過程更換維持液，繼續培養至病毒增值高峰期(22～26 d)收獲病毒，得到疫苗代次病毒(K11)。 按上述方法，通過8個周期連續傳代，得到K12～K18不同代次的病毒，凍存于-20 ℃待用。

1.4病毒感染性滴度檢測取不同代次的病毒液(K7,K10,K11,K13,K15,K18)，超聲破碎后作10倍系列稀釋，每個稀釋度接種5個小方瓶，然后將小方瓶放入37 ℃恒溫培養2 h取出，加入培養液，放入35 ℃恒溫培養至24 d收獲病毒，然后用ELISA法檢測病毒感染性滴度(lgCCID50/ml)。

1.5病毒基因組RNA提取取不同代次的病毒經凍融、超聲破碎后，8 000×g離心1 min，分別取上清150 μl，按QIAamp Viral RNA Kit說明書提取病毒RNA，洗脫得到病毒RNA。

1.6病毒基因組測序將提取得到的RNA，送上海源序生物科技有限公司進行全基因組測序。通過高通量測序技術(Illumina HiSeqTM2500)得到原始測序序列，對Raw Data進行統計分析，通過序列mapping統計堿基分布。

1.7基因序列對比分析將二代測序得到的數據，以主代毒種K7的全基因序列為基準，將不同代次的病毒(K10,K11,K13,K15,K18)的全基因組變化情況用PRISM軟件進行比較分析， 研究HAV不同代次病毒在5′端非編碼區、VP1-2 A、2B、2C區及重要神經毒力相關位點的堿基序列差異及變異情況。

2　結果

2.1感染性滴度檢測H2株不同代次病毒的感染性滴度維持在7.76～8.50 lgCCID50/ml之間,P值為0.981差異無統計學意義，表明不同代次病毒在KMB17細胞中的感染性穩定，未發生較大變化。(見圖1)

圖1　H2株不同代次病毒的感染性滴度Fig.1　Infectious titers of different passages of H2 Virus

圖2　H2株不同代次病毒在5′NCR重要位點的突變率Fig.2　Mutation rate of different passages virus of H2 strain at 5’non coding region

2.2堿基分布可信度分析分析堿基可信度，Q20數據可信度在92.94%～97.53%，Q30數據可信度在87.87%～94.18%，表明本試驗數據可靠，可作進一步的分析。(見表1)

2.3基因突變率及位點統計通過smartools找到序列中每個堿基的覆蓋度，計算每個位點的突變率，不同代次病毒在全基因段均有同義突變和非同義突變，但同義突變率均小于4.35%, 非同義突變變異均率小于0.58%(見表2)。

表1　Solexa(二代)測序結果統計堿基分布

表2　不同代次病毒與K7主代毒種相比較的突變率統計

圖3　H2株不同代次病毒在VP1/2 A，2B，2C，3 A區突變位點的突變率Fig.3　Mutation rate of different passages virus of H2 strain at VP1/2 A，2B，2C，3 A regions

2.4不同代次病毒在關鍵基因段及毒力位點的非同義突變情況H2株病毒不同代次的5′NCR非編碼區基因序列有少量變異，整個病毒基因的5′ NCR區的序列相對同源性高、變異很小，最高突變率為：nt124位點0.999%(見圖2)。病毒在連續傳代后，在VP1/2 A，2B，2C和重要基因位點未發生明顯突變，基因結構較為穩定,最高突變率為：nt4 222位點0.999%(見圖3)。

3　討論

3.1病毒感染性甲型肝炎減毒活疫苗H2株主代毒種K7在KMB17人胚肺二倍體細胞上經連續傳代至K18，通過對不同代次病毒的感染性滴度進行檢測和對比檢測，病毒的感染性滴度維持在7.76～8.50 lgCCID50/ml之間，較為穩定，差異無統計學意義。結果表明，H2株主代毒種K7在經過KMB17細胞傳代11次的過程中，不同代次的病毒感染性沒有發生明顯差異，感染性穩定。

3.25′NCR區基因基因突變率分析結合Cohen[13-15]、Funkhouser[16]和周德久[17]等進行的研究結果，我們將H2株不同代次病毒的5′ NCR基因序列區段(nt1～nt750)進行了比較分析，發現K7在傳代過程中，不同代次病毒(K10,K11,K13,K15,K18)在整個5′NCR基因區段，與K7主代毒株同源性高、變異很小，除特定區段少數位點發生變化之外，大部份的基因未發生突變，總體突變率<0.1%。這可能是因為H2株在主代次毒種以前，經長期傳代適應了KMB17細胞株后較為穩定，連續傳代過程中變異率極低。

Schultz[18]的研究中，將HM175野毒株與HM175/P16細胞適應株進行對比，認為nt 203、204堿基缺失和nt 687位的堿基替換(U687G)是野毒株適應細胞株的特征，這幾個變化能夠增強核糖體進入位點的無帽翻譯過程，增加病毒在細胞中的適應能力。我們將H2株不同代次病毒(K7,K10,K11,K13,K15,K18)的檢測結果與之相對比，結果表明在nt 203未發生缺失，而在nt 204位堿基缺失情況與此前文獻報導一致，各代次病毒在nt687位點100%為G，為適應細胞培養特征。

3.3VP1/2A、2B、2C毒力位特征位點基因突變率分析根據Emersor等[19-21]研究證明，HAV的毒力基因主要在VP1/2 A、2B、2C區, 毒力相關基因簇位與細胞適應相關的核酸位點主要分布在P2區。其中VP1/2 A連接區的(nt3 024～3 196)的168個核苷酸，是目前國際通過的HAV基因分型標準位點。我們將H2株各代次病毒(K10,K11,K13,K15,K18)測序結果與數據庫中HM175的減毒株序列對比，在片段V P1/2 A 連接區nt3024 ～nt3191(168 bp,HM-175)與GenBank 庫中全部HAV序列進行核苷酸/氨基酸同源性進行分析，結果證明K7主代毒種及經多次傳后的各代次病毒的毒力特征，仍然與M-175/7MK-5 的同源性最高。按照目前國際通用的HAV基因分型標準，基因型屬于IB亞型。與主代K7相比，不同代次病毒在全基因段均有同義突變和非同義突變，但同義突變率小于4.35%，非同義突變率小于0.58%，表明毒株經過連續傳代后，基因變異情況非常小，保持穩定的減毒株型別特征。

在HAV病毒毒力位點中，椐Robertson[22]、Paulmann[23]等的文獻報導其中比較關鍵的位點有：VP1/2 A區的nt3 025、3 196，2B區的nt3 889、3 919，2C區的nt 4 043、4 073、4 087、4 185、4 222、4 563、4 987。我們的研究結果顯示上述位點突變率為0.0027%～0.675% 之間，變異率極低。本研究中H2株各代次病毒的2C 基因位點nt 4 185(2C/Lys64)與文獻報道的其他疫苗株一致，并且非常穩定，此位點可能參與病毒的減毒[24-25]。檢測結果與之相同,K18代病毒次在nt3 196、 4 043、4 073、4 222均發現較前代次基因發生變異相對較多,突變率在0.006%～0.99%之間,試驗數據表明隨著病毒傳代次數的增加，病毒在多個基因位點突變率有所增加，但未超過1%。在K10，K11，K13，K15代病毒序列中， nt4 987位點的核苷酸發生A變為G(2C/A4987G)，及2C區氨基酸由Glu變為Gly(2C/Gly331Glu)與劉建生等[26]的研究結果相同，推測與H2株細胞基質特異的適度減毒特征有關。

本試驗用二代測序的方法對H2株各代次病毒進行全基因組測序，發現甲肝病毒H2株各代次病毒在KMB17細胞培養連續傳代過程中，病毒的遺傳穩定性良好，病毒感染性未發生明顯改變。我們建立的方法和獲得的數據，為今后進一步研究甲肝疫苗毒株及其他毒株的遺傳穩定性打下了基礎，也為研究疫苗的批間一致性提供了新的研究思路。

利益沖突:無

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