羊瘙癢因子感染小鼠腦組織中MicroRNA-375對PDK1蛋白表達調控研究

石強　張麗娜　王晶　高晨

102206 北京，中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室

朊病毒病(prion disease)是一種具有感染性，能夠引起人類和動物中樞神經系統退行性改變的疾病，又被稱之為傳播性海綿樣腦病(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)。它是體內基因編碼的正常朊蛋白(PrPC)構象發生改變，形成致病的朊病毒(PrPSc)在神經組織內聚集沉積引起的[1]。

PrPC蛋白具有多種水解方式，其中PrPC的α切割被認為具有保護機體的作用[2-3]。3’磷酸肌醇依賴的激酶1(3’-phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK1)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，PDK1活性增加可以促進腫瘤壞死因子轉化酶(TACE)的內吞作用，降低α-切割活性，從而促進疾病的進展[4]。目前在腫瘤學上的一些實驗結果表明micro RNA-375(miR-375)能夠與PDK1的3’-UTR上的靶點結合，從而調控PDK1在細胞內的表達和活性[5-7]，而miR-375在朊病毒病中對PDK1的調節作用尚未見文獻報道。本研究對羊瘙癢因子139 A感染的小鼠腦組織中miR-375與PDK1的含量變化進行了測定，并通過pmiR-REPORT報道質粒系統檢測了miR-375對PDK1 3’UTR的靶點的調控功能，從而來探究二者在朊病毒病發生發展過程中的關系。

1　材料與方法

1.1材料Trizol購自 Invitrogen 公司; miRcute miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒為 TIANGEN公司產品; miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)購自TIANGEN公司。SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司; 硝酸纖維素膜(NC)0.4 μm購自 Millipore 公司; 脫脂奶粉(Skim Milk Powder) 購自 BD公司; 蛋白酶 K(proteinase K)購自Merck 公司; 吐溫-20、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)、三羥甲基氨基甲烷 (Tris) 均購自Amresco公司; Triton-X100 購自Solarbio公司; PDK1抗體購自 Sigma 公司; 正常山羊血清封閉液、抗體稀釋液、DAB 顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司; 抗淬滅熒光封片劑購自碧云天生物技術公司; 其他試劑為國產分析純化學試劑。

1.2總RNA的提取及qRT-PCR采用RNeasy mini kit 提取試劑盒(德國Qiagen)，提取139 A毒株感染終末期及正常C57小鼠腦組織中的總RNA，具體操作嚴格按照說明書進行。提取后的總RNA利用miRcute 增強型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒，通過兩步法特異性的將總RNA中的miRNA 進行轉錄合成cDNA。利用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒(SYBR Green)檢測cDNA中miRNA-375的含量。miR-375特異性引物及內參U48由亞太恒信生物科技有限公司提供，反應體系為20 μl，包括2×miRcute miRNA Premix(SYBR&ROX)10 μl，正向引物 2 μl，反向引物2 μl，miRNA第一鏈cDNA稀釋10倍后加2 μl，RNase-Free ddH2O 4 μl。同時設立三個復孔。實驗過程中所用試劑都應置于冰上。PCR反應程序設定：94 ℃變性2 min；94 ℃循環中變性20 s，60 ℃退火、延伸34 s，共45個循環。

1.3二代測序及生物信息學分析構建cDNA文庫后借助Solexa/Illumina 平臺進行深度測序(華大基因公司)。過程簡介如下：5 μg的總RNA樣品進行SDS電泳，根據泳動位置的不同，回收miRNA(18-24nt)。然后應用T4 RNA連接酶在miRNA的5′-和3′-端連接接頭，并進行反轉錄。反轉錄的產物進行PCR，反應條件為：98 ℃ 30 s，98 ℃ 10 s 15個循環，72 ℃ 15 s，72℃10 min，擴增產物進行下一步的測序。具體可參見文獻[8]。

1.4免疫印跡法分別取139 A感染的C57小鼠腦組織和正常C57小鼠腦組織，用適量裂解液重懸制備成10%(W/V)腦組織勻漿。取10 μl腦勻漿加入2.5 μl 5×的上樣緩沖液，混合均勻后于100 ℃水浴10 min。待樣品室溫后，離心進行上樣。進行常規SDS-PAGE電泳，電泳結束后半干法轉膜；10%脫脂奶粉室溫封閉2 h, 1×TBST充分洗膜。然后PDK1小鼠一抗(1∶5 000)和β-actin(1∶5 000)抗體4 ℃孵育過夜；次日，1×TBST充分洗膜，辣根過氧化物酶標記兔抗小鼠二抗室溫孵育1.5 h，充分洗膜后，暗室中進行ECL顯影。

1.5免疫組織化學將正常小鼠及139 A感染小鼠終末期的腦組織進行組織固定、脫水和石蠟包埋并用切片機制成厚度為5 μm連續切片。晾干后進行脫蠟和抗原微波修復，用3% H2O2室溫作用10 min，以阻斷內源性過氧化物酶。滴加0.3% Triton-X 100室溫作用20 min做切片通透，正常山羊血清封閉后，滴加兔抗小鼠PDK1抗體并置于濕盒，4 ℃過夜。次日切片37 ℃復溫后加入生物素標記的二抗，室溫避光30 min后加入DAB顯色，用蘇木素復染1 min，常規脫水后加封片劑顯微鏡觀察并用 OLYMPUS DP Controller 軟件拍攝照片。

1.6利用熒光報道質粒PmiR-REPORT對miR-375靶點PDK1 3’UTR 的檢測

圖1　139A感染小鼠腦組織中PDK1蛋白的Western blot檢測Fig.1　Detection of PDK1 in 139 A infected mice brain by Western blot

圖2　免疫組織化學法檢測139 A感染小鼠腦組織中的PDK1蛋白Fig.2　Detection of PDK1 in 139 A infected mice brain by immunohistochemistry

1.6.1質粒的構建報告基因表達載體制備: 根據人PDK1基因序列信息，使用TargetScan 軟件預測PDK1基因3’UTR 與miR-375 可能存在的結合位點，結合位點5’-GAACAA-3’ 位于PDK1基因3’UTR 區的第273-279位。設計合成互補堿基序列，5’-ACCCAACCACACAAAGAACAAAA-3’ 和5’-TTTTGTTCTTTGTG TGGTTGGGT-3’。2條單鏈經退火后形成雙鏈DNA并克隆至熒光素酶報告基因表達載體 pmiR-REPORT (Ambion，美國) 構建成野生型報告基因表達載體pmiR-WT-375。陰性對照序列為5’-ACCCAACCACACCCCTCCTGGGG-3’; 5’-CCCCAGGAGGGGTGTGGT TGGGT-3’。構建含有錯義突變結合位點的pmiR-MT-375。重組載體經過序列分析后進行無內毒素質粒DNA制備。

1.6.2細胞培養及轉染: 復蘇人神經母細胞瘤細胞，用含10%胎牛血清的DMEM 培養基培養，接種適當數量細胞于96孔板, 37 ℃二氧化碳恒溫培養箱培養48～72 h，待細胞融合70%后進行轉染。陰性對照為空 pmiR-REPORT 真核表達載體。將真核表達質粒pmiR-WT-375和pmiR-MT-375分別和pCMV-β-gal、合成的miR-375 mimic和miR-375 inhibitor共同感染SH-SY5Y細胞系。質粒每孔0.4 μg，RNA mimic 和inhibitor 分別為20pmol。轉染過程按照轉染試Lipofectamine 2000 說明書進行。每組設置3個復孔。轉染后48 h后使用熒光素酶檢測儀檢測熒光素酶含量。β-gal活性用ONPG試劑進行檢測，具體方法見文獻[9]。

2　結果

2.1蛋白免疫印跡檢測腦組織中的PDK1羊瘙癢因子139 A感染的小鼠腦組織中Western blot顯示，感染小鼠腦組織中PDK1的含量相對于正常對照組明顯增高(圖1)。 將Western blot結果進行灰度值掃描分析，139 A感染組PDK1含量相對于對照組升高6倍左右，具有統計學差異(圖1)。結果提示，感染139 A小鼠終末期腦組織中PDK1的含量增加。

2.2免疫組織化學檢測腦組織中的PDK1為了進一步探究PDK1在139 A感染小鼠腦組織中的變化情況，制備了139 A感染小鼠終末期腦組織(皮質區)切片。并進行PDK1特異性免疫學組織化學實驗。結果顯示，與正常的小鼠腦組織切片相比， 139 A感染小鼠腦組織中大量的PDK1特異性棕色斑點散在存在，而在正常腦組織中只存在少量的棕色斑點(圖2)。結果提示139 A感染的小鼠腦組織切片中PDK1的含量較對照組明顯增高，與免疫印跡結果相吻合。

2.3體外qRT-PCR及二代測序檢測腦組織中miR-375含量有研究對scrapie感染的N2a細胞模型進行了miRNA表達譜的比較，發現miR-375在感染細胞中相對于正常細胞明顯降低[10]。為了探究miR-375在感染羊瘙癢因子139 A的小鼠腦組織中含量的變化。本研究利用二代測序和體外qRT-PCR的方法分別對腦組織中miR-375的含量進行了檢測。如圖3所示，二代測序結果發現朊病毒感染模型139 A腦組織中的miR-375的含量明顯降低。以U6作為內參進行體外qRT-PCR，結果同樣顯示139 A腦組織中miR-375的含量降低，且均具有統計學意義。

圖3　二代測序與體外qRT-PCR檢測miR-375的差異表達Fig.3　RT-qPCR and NGS detection of miR-375 in 139 A infected mice brain

圖4　miR-375類似物及抑制物對PDK1 3’UTR的靶點的調控Fig.4　Regulation of miR-375 mimics and inhibitors on targets of PDK1 3’UTR

2.4PmiR-REPORT報道質粒系統檢測miR-375對PDK13’UTR的靶點的調控功能有研究表明miR-375能夠與PDK1的3’-UTR上的靶點結合，從而調控PDK1在細胞內的表達和活性，在對miR-375的作用靶點蛋白的生物信息學分析中，發現PDK1是其作用靶標之一，而PDK1正是影響著α-內切酶-TACE活性的重要因子之一[4]。為了探究miR-375在朊病毒感染小鼠中與PDK1的關系本研究利用pmiR-report報道質粒系統對miR-375的調控功能進行了檢測。

從圖4中可以觀察到，僅轉染帶有PDK1的3’-UTR的野生型(pmiR-WT-375)和突變型(pmiR-MT-375)的實驗組，熒光素酶的表達量基本相似。當野生型實驗組中加入miR-375的類似物時，熒光素酶的含量明顯降低，而當加入抑制物時，熒光素酶含量明顯增加，與之形成對比的突變型實驗組的熒光酶活性不受類似物和抑制物的影響，可推斷出PDK1的3’-UTR受到miR-375的調控。

3　討論

朊病毒病是一種致死率高達100%的神經退行性疾病，嚴重影響著人類的健康，雖然科學家進行了不懈的努力，但其致病機制并不十分清楚，目前臨床上也沒有行之有效的治療方法。因此，克-雅病疾病進展中，針對PrPCα切割及其內切酶變化的一些分子標記物的研究，不僅可以有助于了解朊病毒的致病機制，而且有助于疾病的診斷，甚至是早期診斷。而以提高PrPCα內切酶活性，以促進PrP蛋白α切割為靶點的治療策略也是一個充滿了希望的新的治療方向[11]。

miRNA作為一種不編碼蛋白質，但是在基因的表達調控過程中發揮著非常重要作用的非編碼RNA，其在腦組織中高度保守，并且含量十分豐富，提示它在腦組織的生理和病理功能中有重要的調節作用[12-14]，近年來關于miRNA和神經退行性疾病之間的關系也越來越成為研究的熱點。在AD患者的海馬區發現有異常miRNA的增加[15]；患者腦組織的芯片分析也顯示即使在早期的AD患者中，miR-107也有明顯的下調；BACE1酶是切割淀粉樣前體蛋白APP產生阿爾茨海默病病理特征Aβ的主要成分，而研究表明，編碼BACE1酶的mRNA水平的調控受miR-107影響[16]。同時June[17]研究小組也發現高水平miR-7會導致α-synuclein的增加。亨廷頓病(Huntington disease，HD)中一些miRNA的表達影響著與疾病相關基因的轉錄和翻譯[18]。這些研究結果不斷地提示本研究在朊病毒感染的過程中miRNA扮演著非常重要的角色，如果能發現朊病毒感染過程中的異常miRNA，并找出miRNA調節的下游蛋白，這將對朊病毒致病機制的研究起到很大的幫助作用。

本實驗通過建立朊病毒139 A感染小鼠的動物模型，發現小鼠感染羊瘙癢因子139 A后腦組織中miR-375表達下調，且腦組織中的PDK1蛋白含量明顯增多。通過pmiR-REPORT報道質粒系統檢測發現miR-375具有對PDK1 3’UTR靶點的調控功能。本研究結果提示PDK1 3’UTR是miR-375的一個調控靶點。在朊病毒病的發生發展過程中miR-375發生下調，可能對PDK1 3’UTR這一靶點的調控作用下降，使得腦組織中PDK1的含量升高。而PDK1活性的增加可以抑制α-切割活性，從而影響了PrP蛋白的正常水解過程，從而促進了疾病的進展。這為探討朊病毒病致病機制提供了新的線索，為朊病毒病的治療甚至是診斷方面可以提供新的理論依據。

利益沖突無

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