急性和慢性乙型病毒性肝炎中自然殺傷細胞的功能研究

曹衛華　吳淑玲　冉崇平　齊天林　王星月　屈曉晶　張丹　張璐　路遙　郝紅曉　常敏　胡蕾蘋　劉如玉　吳云忠　楊民　華文浩　劉順愛　李明慧　謝堯

100015 北京大學地壇醫院教學醫院肝病中心(曹衛華、謝堯)；100015 北京，首都醫科大學附屬北京地壇醫院肝病中心(吳淑玲、冉崇平、齊天林、王星月、屈曉晶、張丹、張璐、路遙、郝紅曉、常敏、胡蕾蘋、劉如玉、吳云忠、楊民、李明慧)，檢驗科(華文浩)，傳染病研究所(劉順愛)

HBV感染的發病機制是由宿主免疫、肝細胞和病毒之間相互作用所介導的免疫應答[1]。大約95%成人發生HBV感染后表現為急性、自限性，而約90%新生兒感染后進展為慢性[2]。NK細胞是一種來源于骨髓的淋巴細胞，屬于固有免疫系統的主要效應細胞。NK細胞不僅在病毒的清除中發揮重要作用，而且參與肝臟組織損傷過程[3-4]。CD56brightNK和CD56dimNK是NK細胞的亞群，CD56brightNK細胞主要功能是分泌細胞因子，如TNF-α、IFN-γ、IL-10等，通過非細胞毒性作用發揮抗病毒作用，CD56dimNK細胞通過顆粒酶和穿孔素介導細胞毒作用殺傷病毒感染的肝細胞[5]。NKp46為NK細胞的活化性受體，急性乙型肝炎感染中，NKp46受體表達上調，NK細胞活性增強[6]; NK細胞表面還表達受體IFNAR2，IFNAR2表達上調可使得IFN-a更易激活NK細胞，發揮抗病毒作用，有利于清除病毒。該研究通過探討急、慢性HBV感染患者外周血NK細胞及其亞群的頻數，NK細胞表面功能分子IFNAR2、NKp46的表達情況，并分析它們與ALT、HBV DNA以及HBV markers相關性，從而助于進一步了解自然殺傷細胞在急、慢性HBV感染中的作用。

1　材料與方法

1.1研究對象自2014年10月至2017年7月，本研究入組126例在首都醫科大學附屬北京地壇醫院就診的患者，包括急性乙型病毒性肝炎和慢性乙型病毒性肝炎免疫活動期兩組，這些患者均未曾接受治療，其中有12例急性乙型病毒性肝炎患者失訪。急性乙型病毒性肝炎參照診斷標準[6]，慢性乙型病毒性肝炎診斷標準參照文獻[7]。排除標準：除外HBV以外的其它病毒感染者；梅毒、艾滋抗體陽性者除外；除外伴脂肪肝、自身免疫性肝病、酒精性肝病、肝臟代謝性疾病、肝纖維化、肝硬化以及肝癌等其它肝臟疾病者。本研究已通過首都醫科大學附屬北京地壇醫院倫理委員會審核，入組每位研究對象均已簽署知情同意書。

1.2臨床指標檢測視情況而定，每隔3個月檢測病毒學指標(HBeAg、HBsAg和HBV DNA)、生化指標(ALT、AST、TBIL、DBIL等)、血常規等，這些指標均由首都醫科大學附屬北京地壇醫院檢驗科提供。

1.3血樣采集利用EDTA 抗凝紫管采集患者血樣2 ml，經處理后4 h內使用BD FACS Calibur上機收集細胞。

1.4細胞表型染色及流式細胞儀分析用Anti-Human IFNAR2-FITC，Mouse anti-Human-CD3- PerCP，Mouse anti-Human CD56-APC和anti-Human CD335(NKp46)-PE四種抗體檢測NK細胞，并用FlowJo7.6分析數據。

1.5統計學方法應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，所有數據以均數±標準差(mean ± SEM)或中位數、四分位數間距[median (Q1, Q3)]或box-and-whisker plots呈現，利用GraphPad Prism 5分析。組內比較用Wilcoxon檢驗，多組間兩兩比較用Mann-Whitney U 檢驗。變量的相關性分析采用線性回歸分析。P<0.05被認為有統計學意義。

2　結果

2.1IA和AHB兩組間基線HBVDNA含量、血清HBsAg、HBeAg水平及ALT水平入組IA組94人、AHB組32人，入組患者的基本信息如表1所示。

表2　IA、AHB、AHB-R組間NK細胞及其亞群細胞頻數和功能分子

注：AHB，急性乙型病毒性肝炎組；IA，免疫活動期；AHB-R，急性乙型病毒性肝炎恢復期；P<0.05差異有統計學意義

Note: AHB, acute hepatitis B; IA, immune activity; AHB-R, acute hepatitis B recovery period;P<0.05 was considered statistically significant

2.2在IA和AHB組NK細胞及其亞群細胞頻數和功能分子表達表2結果顯示：IA組與AHB組相比，IA組NK 和NKp46dimNK細胞頻數顯著高于AHB組; AHB組NKp46highNK細胞頻數顯著高于IA組，而CD56brightNK頻數、CD56dimNK頻數、IFNAR2+NK、NKp46+NK細胞頻數和IFNAR2MFI、NKp46MFI水平在兩組間無顯著的統計學差異。AHB組和AHB-R組相比，各個指標間未得出顯著的統計學差異，但是AHB-R組CD56brightNK、IFNAR2+NK、NKp46+NK和NKp46dimNK細胞頻數中位數值高于AHB組，AHB組IFNAR2MFI、NKp46MFI中位數值高于AHB-R組。

表1　IA和AHB入組患者基本特征

注：AHB，急性乙型病毒性肝炎組；IC，慢乙肝免疫活動期；P<0.05 差異有統計學意義

Note: AHB, acute hepatitis B; IA, immune activity;P<0.05 was considered statistically significant

2.320例急乙肝恢復患者NK細胞及其亞群細胞頻數以及細胞表面功能分子表達在入組的31例急乙肝患者中20例在24周時恢復，急乙肝恢復期NK細胞和NKp46dimNK細胞頻數顯著高于急性炎癥期NK和NKp46dimNK細胞頻數，急乙肝恢復期NKp46highNK細胞頻數顯著低于急性炎癥期(表3)，而CD56brightNK、CD56dimNK、IFNAR2+NK、NKp46+NK細胞頻數和IFNAR2MFI、NKp46MFI在急乙肝恢復前后無顯著的統計學差異(表3)，但是由圖1中可以看出在急乙肝恢復前后CD56brightNK、CD56dimNK、IFNAR2+NK、NKp46+NK細胞頻數和IFNAR2MFI、NKp46MFI存在變化趨勢：CD56brightNK、IFNAR2MFI、NKp46MFI頻數在急乙肝恢復后有下降趨勢(圖1)，而CD56dimNK(圖1)、IFNAR2+NK和NKp46+NK(圖2)細胞頻數則呈上升趨勢。

圖1　20例急性乙型肝炎恢復患者外周血NK細胞、CD56brightNK和CD56dimNK細胞所占的頻數的變化趨勢Fig.1　The changing trend of frequency of NK cells, CD56brightNK cells and CD56dimNK cells in peripheral blood in the recovery of 20 patients with acute hepatitis B

AHB-IAHB-RP入組數(N)2020NK/LY(%)median(Q1,Q3)10.04(5.78,13.18)15.15(10.45,17.70)0.001CD56brightNK/NK(%)median(Q1,Q3)9.04(5.30,12.69)8.85(7.03,10.11)0.535CD56dimNK/NK(%)median(Q1,Q3)90.66(85.64,92.79)90.73(86.44,92.60)0.984IFNAR2+NK/NK(%)median(Q1,Q3)4.45(1.91,5.55)4.55(2.34,5.94)0.367IFNAR2MFImedian(Q1,Q3)23.85(16.88,30.68)20.05(14.68,25.78)0.157NKp46+NK/NK(%)median(Q1,Q3)91.15(86.10,94.98)94.60(92.78,95.78)0.521NKp46MFImedian(Q1,Q3)106.50(63.15,156.00)75.10(51.58,102.25)0.769NKp46highNK/NK(%)median(Q1,Q3)15.70(7.20,20.60)9.39(6.92,11.83)0.001NKp46dimNK/NK(%)median(Q1,Q3)73.45(68.15,84.25)86.90(83.18,90.10)<0.001

注：AHB-I，急性乙型病毒性肝炎炎癥期；AHB-R，急性乙型病毒性肝炎恢復期；P<0.05差異有統計學意義

Note: AHB-I, acute hepatitis B inflammation period; AHB-R, acute hepatitis B recovery period;P< 0.05 was considered statistically significant

2.4臨床指標(ALT、HBeAg、HBsAg和HBVDNA)與NK細胞的相關性分析在AHB組HBV DNA與ALT(r=0.394,P=0.026)呈正相關，但是在IA組HBV DNA、HBsAg、HBeAg與ALT、NK細胞及其亞群細胞頻數和NK細胞表面功能分子表達水平均無相關性。而通過對所有指標在急乙肝恢復前后差值的相關性分析得出：ΔHBV DNA和ΔALT呈正相關(圖3 A)、與ΔNK/LY(%)呈正相關(圖3B)；圖4所示：ΔALT與ΔNKp46highNK頻數、ΔNKp46MFI、ΔIFNAR2MFI呈正相關。

3　討論

急性乙型病毒性肝炎和慢性乙型病毒性肝炎是兩種不同的HBV感染狀態，其臨床結局也完全不同。本研究結果顯示，急乙肝炎癥期NK細胞總數低于慢乙肝，可能因為NK細胞被募集到肝臟而發揮作用，使得外周血NK細胞頻數下降；而急乙肝CD56dimNK、ΔNKp46highNK細胞頻數高于慢乙肝，這些細胞具有細胞毒性作用，參與病毒感染的清除，同時IFNAR2表達水平在急乙肝炎癥期高于慢乙肝，在感染早期時，急乙肝NK細胞更易被激活而發揮抗病毒作用，利于病毒被清除[8]。在急乙肝炎癥期，HBV DNA病毒載量與ALT水平呈正相關，病毒刺激NK細胞活化，發揮抗病毒作用，既有細胞毒性作用又參與肝臟損傷過程[9]，這就可以解釋急性乙型肝炎時患者可以清除病毒，而慢性乙型肝炎者則不可以。

圖2　20例急性乙型肝炎恢復患者外周血IFNAR2+NK、NKp46+NK、NKp46highNK、 NKp46dimNK細胞所占的頻數及功能分子IFNAR2、NKp46平均熒光強度的變化趨勢Fig.2　The changing trend of frequency of IFNAR2+NK cells, NKp46+NK cells, NKp46highNK cells and NKp46dimNK cells, and IFNAR2MFI, NKp46MFI in peripheral blood in the recovery of 20 patients with acute hepatitis B

圖3　HBV DNA 在急乙肝恢復前后差值的變化與ALT及NK細胞頻數的相關性Fig.3　The association of ΔHBV DNA and ΔALT, ΔNK cells before and after acute hepatitis B recovery

圖4　ALT在急乙肝恢復前后差值與NKp46highNK細胞頻數差值及IFNAR2MFI和NKp46MFI差值的相關性Fig.4　The association of ΔALT and ΔNKp46highNK, ΔIFNAR2MFI, ΔNKp46MFI before and after acute hepatitis B recovery

大多數成人發生HBV感染后通過有效的免疫應答可將病毒清除。有研究顯示，急性乙型肝炎中，NK細胞在感染早期優先被激活[10]，本研究結果顯示,急乙肝炎癥期NK細胞頻數低于恢復期，可能因在炎癥期，NK細胞被招募至肝臟發揮抗病毒作用，外周血NK細胞相對減少，而在恢復期，肝臟中的病毒被清除，NK細胞不再向肝臟中遷移，外周血NK細胞數反而上升。本研究還發現，急乙肝炎癥期CD56brightNK細胞頻數高于恢復期，NKp46highNK細胞頻數及功能分子NKp46和IFNAR2表達水平在急乙肝恢復過程中呈現下降趨勢，本研究還發現，在急乙肝恢復中ALT的變化與NKp46highNK細胞頻數、NKp46MFI、IFNAR2MFI的變化呈現正相關，這就說明急乙肝炎癥期，NK細胞活化[11-12]，發揮抗病毒作用以及參與肝臟炎癥損傷過程[13]，NKp46和IFNAR2表達上調更有利于清除病毒[6,14]。

在HBV感染過程中，有很多因素參與其中，不僅包括免疫細胞，還有很多的細胞因子和趨化因子等等。本研究雖然證明在NK細胞在急、慢性乙型病毒性肝炎發病和轉歸中的作用，但是并沒有研究細胞因子在其中的作用，因此，需要更進一步研究其機制。

總之，雖然NK細胞具有雙重作用，在發揮抗病毒過程中也會導致肝臟組織的損傷，但是不同的感染階段NK細胞發揮作用的機制也不同，因此，針對性地增加NK細胞分泌細胞因子作用而減弱其細胞毒性作用，從而減弱對肝臟組織的損傷作用，這對以后HBV感染的治療提供了新思路。

利益沖突：無

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