巖溶石灰土微生物豐度的影響因素及其指示意義

朱美娜，梁月明*，劉暢，靳振江，李強(qiáng)*

1. 中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)研究所，國(guó)土資源部//廣西巖溶動(dòng)力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；2. 聯(lián)合國(guó)教科文組織國(guó)際巖溶研究中心，廣西 桂林 541004；3. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西 桂林 541006

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，不僅參與土壤養(yǎng)分循環(huán)（劉麗等，2013），還對(duì)外界環(huán)境變化反應(yīng)非常敏感（賀紀(jì)正等，2013；李瑞等，2017），因此土壤微生物具有調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)的功能及指示作用。微生物的指示作用已在土壤重金屬污染、石漠化恢復(fù)以及土壤質(zhì)量評(píng)估方面得到應(yīng)用（李韻詩(shī)等，2015；朱新玉等，2014；Xie et al.，2015；周衛(wèi)紅等，2017），還有學(xué)者（賀鳳鵬等，2016）利用土層之間的微生物學(xué)特征來評(píng)價(jià)草地生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況，從而為利用土壤微生物評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量提供新思路和依據(jù)。

巖溶土壤主要以發(fā)育于碳酸鹽巖母質(zhì)上的非地帶性土壤——石灰土為主，其隸屬于初育土綱，石質(zhì)初育土亞綱，石灰（巖）土類，下有黑色石灰土、棕色石灰土、黃色石灰土和紅色石灰土4個(gè)亞類（張美良等，1994）。不同亞類的土壤其物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)都有所差異。盡管關(guān)于巖溶生態(tài)系統(tǒng)中土壤的理化性質(zhì)已有較深入的研究和報(bào)道（鄧艷等，2009；楊柳等，2011；藍(lán)家程等，2011），但有關(guān)不同亞類石灰土的生物學(xué)特征及土壤質(zhì)量的研究相對(duì)薄弱。馮書珍等（2015）探究了巖溶區(qū)原生林不同坡位土層（0～10、30～50和70～100 cm）對(duì)土壤微生物豐度的影響，認(rèn)為微生物豐度對(duì)土層的響應(yīng)強(qiáng)于坡位，并且微生物豐度受土壤養(yǎng)分中堿解氮、速效磷、速效鉀影響顯著。也有學(xué)者（葛云輝等，2012）以廣西環(huán)江縣巖溶區(qū)的棕色石灰土、黑色石灰土為研究對(duì)象，探究添加外源14C-稻草和Ca14CO3對(duì)土壤微生物群落豐度的影響。然而，很少有學(xué)者細(xì)化土壤梯度分析，更極少有學(xué)者將微生物與土壤類型關(guān)系及石灰土成土機(jī)理相聯(lián)系。此外，關(guān)于利用土層之間土壤微生物學(xué)特征的差異評(píng)價(jià)巖溶石灰土土壤質(zhì)量還鮮有報(bào)道。

本研究以廣西人為干擾較弱的兩種典型石灰土（黃色石灰土和紅色石灰土）為研究對(duì)象，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)探討細(xì)菌與真菌豐度對(duì)土壤類型及層位（0～10 cm 表層土，10～20、20～40、40～60、60～80和80～100 cm）的響應(yīng)，旨在探究巖溶石灰土微生物豐度的影響因素，為利用土壤微生物豐度在層位之間的特征差異評(píng)價(jià)巖溶區(qū)土壤質(zhì)量研究提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　研究樣區(qū)

黃色石灰土取自百色市（24°42'N，106°30'E），紅色石灰土取自來賓市（23°25'N，109°30'E）。百色市氣候?qū)賮啛釒Ъ撅L(fēng)氣候，年平均氣溫為19.0～22.1 ℃，年平均降雨量約為 1114.9 mm；來賓市地處中亞熱帶向南亞熱帶過渡的季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫為 20.3 ℃，年平均降雨量約為 1360 mm。在人為干擾少的地方布設(shè)樣方，約有10～15 a的休耕史，每個(gè)樣方保持坡位（中坡位）、坡向（北坡）一致。黃色石灰土研究區(qū)主要分布著小果薔薇（Rosa cymosa Tratt）、繅絲花（Rosa roxburghii Tratt）和火棘（Pyracantha fortuneana）。紅色石灰土研究區(qū)主要分布著桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）、檵木（Loropetalum chinense）和紫牡丹（Paeonia delavayi Franch）。

1.2　土壤樣品采集

土壤樣品采集于2015年11月，每個(gè)樣方10 m×10 m，共10個(gè)樣方（包括4個(gè)黃色石灰土樣方和6個(gè)紅色石灰土樣方）。分別采集富含腐殖質(zhì)的表層土，10～20、20～40、40～60、60～80 和 80～100 cm層土樣，共計(jì) 60個(gè)土壤樣品。土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室經(jīng)處理后，一部分保存于-80 ℃冰箱中用于土壤微生物分析，一部分經(jīng)風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3　土壤基本理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤有機(jī)碳用重鉻酸鉀-硫酸氧化法測(cè)定（Bremner，1965）；土壤速效磷經(jīng) 0.5 mol?L-1NaHCO3浸提后用鉬銻抗比色法測(cè)定（Colwell，1963）；溶解有機(jī)碳采用 TOC儀測(cè)定（盛浩等，2015）；全氮采用半微量凱式法測(cè)定（鮑士旦，2000）。

1.4　土壤DNA提取和濃度測(cè)定

按照MOBIO公司土壤DNA快速提取試劑盒說明書提取土壤微生物總DNA，提取的DNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小約為20 kb；利用微量紫外分光光度計(jì)（Quawell 5000，美國(guó)）測(cè)定DNA濃度（c）和純度（p）。DNA 樣品置于-20 ℃冰箱中保存，以供下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)使用。

1.5　實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用熒光定量PCR測(cè)定細(xì)菌16S rRNA、真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)。細(xì)菌引物為F338：5′-CT ACG GGA GGC AGC AG-3′；R518：5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′（Manerkar et al.，2008）。真菌引物為 FUNGI：5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′；NSI：5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′（Li et al.，2010）。細(xì)菌反應(yīng)體系為 25 μL，模板 DNA（genomic DNA，5 ng?μL-1）1 μL，Green-2-Go qPCR Mastermix（Sangon Biotech，上海）12.5 μL，去離子無(wú)菌水9.5 μL，10 μm?μL-1的正向引物和反向引物各 1 μL。真菌反應(yīng)體系為 25 μL，模板 DNA（5 ng?μL-1）1 μL，Green-2-Go qPCR Mastermix（Sangon Biotech，上海）12.5 μL，去離子無(wú)菌水 10.7 μL，10 μm·μL-1的正向引物和反向引物各0.4 μL。

16S rRNA的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸1 min。18S rRNA的擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，39個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。

微生物豐度 A（即核酸拷貝數(shù)，copies?mL-1）計(jì)算公式（梁月明等，2017）如下：

式中，l為DNA長(zhǎng)度。

1.6　統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。差異顯著性采用One-way ANOVA（單因素方差分析）進(jìn)行分析，多重比較采用LSD法，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)法（雙尾檢驗(yàn)）進(jìn)行分析。此外，還運(yùn)用Canoco 5進(jìn)行冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同土壤類型各土層的理化性質(zhì)

由表1可知，黃色石灰土表層土土壤有機(jī)碳、全氮及速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著高于紅色石灰土表層土，而兩種石灰土在其他層位間無(wú)顯著差異。由此說明，兩種石灰土的養(yǎng)分差異性主要體現(xiàn)在表層上。

此外，黃色石灰土土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)與全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均表現(xiàn)出隨土層加深而依次遞減，且表層土的速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著高于其他土層（P=0.004）。同時(shí)，紅色石灰土土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)也呈現(xiàn)出隨土層加深而依次遞減，并且10～20 cm土層速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著高于其下層位的土壤速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)（P=0.012）。

2.2　土壤類型與土層對(duì)微生物豐度的影響

由圖1可知，黃色石灰土與紅色石灰土細(xì)菌豐

度差異性亦主要體現(xiàn)在表層上。兩種石灰土細(xì)菌豐度均表現(xiàn)為隨土層加深而逐漸降低，其在層位間的差異性表現(xiàn)為，黃色石灰土表層土與20 cm以下土層細(xì)菌豐度差異顯著（P=0.027）。紅色石灰土表層土與 40 cm以下土層細(xì)菌豐度差異顯著（P=0.023）。兩種石灰土真菌豐度都以表層土豐度最高，但隨土層加深并未呈規(guī)律遞減。

表1　兩種石灰土土壤理化性質(zhì)在不同土層間的比較Table 1　Comparison on soil physicochemical properties among two kinds of limestone soil types and soil layers

圖1　微生物豐度在土壤類型和土層間的比較Fig. 1　Comparison on soil microbial abundance among different soil types and soil layers

2.3　巖溶石灰土微生物豐度的影響因素

由表2可知，土壤類型對(duì)細(xì)菌豐度具有顯著影響（F=4.413，P=0.041），對(duì)真菌豐度影響不顯著（F=0.016，P=0.901）。土層對(duì)細(xì)菌豐度具有極顯著影響（F=7.225，P=0.000），對(duì)真菌豐度具有顯著影響（F=2.732，P=0.030），從 F值來看，土層對(duì)細(xì)菌豐度的影響高于真菌豐度。土壤類型與土層對(duì)細(xì)菌與真菌豐度的交互作用不明顯。

表2　土壤類型及土層對(duì)細(xì)菌與真菌豐度的雙因素方差分析結(jié)果Table 2　Effect of soil type, soil layers and their interaction on bacterial and fungal abundance by two-way ANOVA

由表3可知，，細(xì)菌豐度與土壤有機(jī)碳、速效磷、全氮均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（P=0.000），與溶解有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P=0.015）。真菌豐度與土壤有機(jī)碳相關(guān)性也達(dá)到了極顯著水平（P=0.005），與速效磷（P=0.011）和全氮（P=0.012）則呈顯著正相關(guān)關(guān)系。不僅微生物與土壤因子存在顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系，微生物之間即細(xì)菌豐度與真菌豐度也呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P=0.000）。

表3　土壤理化性質(zhì)與微生物豐度Pearson相關(guān)性分析Table 3　Pearson correlation among soil physicochemical properties and microbial abundance

RDA分析結(jié)果（表4）表明，土壤有機(jī)碳、全氮、速效磷和溶解有機(jī)碳對(duì)微生物豐度影響的解釋率分別為31.8%、27.2%、21.1%和1.7%，前3種土壤因子累計(jì)解釋率為80.1%，說明土壤有機(jī)碳、全氮、速效磷是影響微生物豐度的主要土壤因子。

表4　土壤微生物豐度主要影響因子Table 4　The main influencing factors of soil microbial abundance

3　討論

3.1　不同石灰土土壤理化性質(zhì)的影響因素

不同亞類石灰土成土年齡、所經(jīng)歷的溶蝕、地形地貌、地上植被、風(fēng)化程度、淋溶程度以及富鈣、鎂的巖溶地球化學(xué)背景不同，會(huì)導(dǎo)致土壤間理化性質(zhì)差異（張美良等，1994；曹建華等，2003；李陽(yáng)兵等，2004；Yuan et al.，2016）。已有研究表明（邸欣月等，2015），石灰土淋溶程度增加，其土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)有降低趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示，兩種典型石灰土土壤理化指標(biāo)存在差異（圖1），且差異性主要體現(xiàn)在表層上，紅色石灰土淋溶程度強(qiáng)于黃色石灰土，可能是造成其土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于后者的原因。靳振江等（2014）研究典型巖溶土壤微生物豐度對(duì)碳循環(huán)的意義，指出微生物較高的豐度和功能活性可加快碳循環(huán)并促進(jìn)土壤有機(jī)碳積累。本研究發(fā)現(xiàn)，黃色石灰土的微生物豐度高于紅色石灰土，土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)同樣表現(xiàn)為黃色石灰土高于紅色石灰土，說明黃色石灰土較高的微生物豐度可促進(jìn)其土壤有機(jī)碳積累，且由于微生物豐度差異主要體現(xiàn)在表層，故不同土層土壤有機(jī)碳存在差異。

本研究區(qū)土層對(duì)土壤養(yǎng)分的影響與大部分地區(qū)一致，均表現(xiàn)為土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、速效磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)等隨著土層的加深而下降，這是由于受上層土壤植被覆蓋、植物殘枝落葉以及根系影響，表層土壤有機(jī)質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高且碳、氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素豐富（王靜婭等，2014）。隨著土層的加深，土壤容重加大，孔隙度減小，養(yǎng)分含量也持續(xù)下降，如不經(jīng)人為擾動(dòng)，表層營(yíng)養(yǎng)元素較難向下遷移（宋賢沖等，2015）。本研究樣地受人為干擾較弱，因此，土壤養(yǎng)分也表現(xiàn)出類似的變化趨勢(shì)。

3.2　影響巖溶石灰土土壤微生物豐度特征的因素分析

土壤微生物大多為異養(yǎng)型，因此其在土壤中的主要限制因素仍為土壤養(yǎng)分。相關(guān)性分析（表3）與RDA分析（表4）結(jié)果均顯示，土壤有機(jī)碳、速效磷和全氮與細(xì)菌、真菌豐度呈極顯著正相關(guān)。雙因素方差分析結(jié)果表明，相比土壤類型，土層深度對(duì)細(xì)菌與真菌豐度的影響更大（表2）。然而，土層深度與土壤類型對(duì)微生物豐度的影響也是由于土壤養(yǎng)分的限制。本研究發(fā)現(xiàn)，土層養(yǎng)分分布趨勢(shì)與細(xì)菌豐度基本一致，兩種石灰土養(yǎng)分差異顯著性時(shí)，其細(xì)菌豐度也差異顯著。說明土壤類型與土層對(duì)微生物豐度的影響主要由各土壤因子造成。正因?yàn)橥翆娱g土壤因子的差異強(qiáng)于土壤類型，故微生物豐度對(duì)土層的響應(yīng)強(qiáng)于土壤類型。此外，細(xì)菌豐度與土壤有機(jī)碳、速效磷及全氮的相關(guān)性強(qiáng)于真菌豐度，說明細(xì)菌對(duì)土壤因子的反應(yīng)更為敏感。Koide et al.（2005）指出競(jìng)爭(zhēng)是構(gòu)建真菌群落的重要因素。細(xì)菌豐度隨土層加深而減少時(shí)，紅色石灰土真菌豐度甚至出現(xiàn)增加的趨勢(shì)，并且真菌可利用的有機(jī)物種類高于細(xì)菌（李宜濃等，2016），二者可能共同造成真菌對(duì)土壤因子的敏感度弱于細(xì)菌。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，不僅土壤因子與微生物豐度存在相關(guān)性，微生物之間即細(xì)菌豐度與真菌豐度在0.01水平呈極顯著正相關(guān)。這是因?yàn)橥寥勒婢鷮?duì)植物殘?jiān)姆纸饽芰O強(qiáng)，可以將纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)類化合物、木質(zhì)素等以及其他類似化合物分解成較簡(jiǎn)單的物質(zhì)，而土壤細(xì)菌參與較簡(jiǎn)單物質(zhì)的分解（王少昆等，2009），因此真菌分解枯枝落葉產(chǎn)生較簡(jiǎn)單物質(zhì)時(shí)可促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，使二者呈極顯著正相關(guān)。真菌對(duì)細(xì)菌的這種促進(jìn)作用也可能是造成細(xì)菌與土層和土壤類型呈顯著正相關(guān)的重要原因。也有學(xué)者指出，土壤有機(jī)碳、速效磷和全氮與細(xì)菌、真菌豐度存在不同程度的顯著正相關(guān)，說明土壤微生物不但參與土壤中 C、N、P循環(huán)（林巧燕，2011），而且還通過細(xì)菌與真菌間的協(xié)同作用參與土壤養(yǎng)分循環(huán)。

3.3　巖溶石灰土土壤微生物豐度的指示意義

黃色石灰土土壤有機(jī)碳、速效磷及全氮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均普遍高于紅色石灰土，說明黃色石灰土養(yǎng)分含量高于紅色石灰土。表層土即腐殖質(zhì)堆積層是對(duì)環(huán)境和人類活動(dòng)變化做出響應(yīng)的第一個(gè)礦化層（Bagherzadeh et al.，2008），而微生物又是以上指標(biāo)中對(duì)環(huán)境及人類活動(dòng)反應(yīng)較為敏感的指標(biāo)（焦海華等，2016）。賀鳳鵬等（2016）用表層（0～10 cm）與10～20 cm土層土壤微生物學(xué)特征的差異性評(píng)價(jià)草地退化程度，其差異性越小說明退化程度越嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，黃色石灰土表層的細(xì)菌豐度與20 cm以下土層差異性顯著，紅色石灰土表層土的細(xì)菌豐度與40 cm以下土層差異顯著，說明紅色石灰土較黃色石灰土貧瘠，此結(jié)果與養(yǎng)分指標(biāo)結(jié)果一致。馮書珍等（2015）對(duì)巖溶原生林不同坡位、土層細(xì)菌豐度進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示下坡位表層（0～10 cm）土與其他土層細(xì)菌豐度差異最顯著，且其土壤養(yǎng)分含量最高。靳振江等（2014）對(duì)典型巖溶洼地、坡地和埡口不同土層細(xì)菌豐度進(jìn)行差異性分析，結(jié)果顯示，坡地表層（0～10 cm）土與其他土層細(xì)菌豐度差異最小，其土壤養(yǎng)分含量亦為最低。由于細(xì)菌豐度對(duì)土壤因子的敏感性強(qiáng)于真菌豐度，故細(xì)菌更適合用于表征土壤質(zhì)量，表層土細(xì)菌豐度與其下土層差異越小，說明土地退化或營(yíng)養(yǎng)貧瘠更為嚴(yán)重。

土壤細(xì)菌不僅具有指示土壤質(zhì)量的作用，而且還因其幾乎參與了土壤全部的生物化學(xué)過程而在石灰土演化過程中起到推進(jìn)作用。有學(xué)者認(rèn)為，土壤鐵還菌希瓦氏菌對(duì)綠脫石進(jìn)行還原之后，其分泌的電子中介體可促使其中的蒙脫石向伊利石轉(zhuǎn)化（Liu et al.，2011；Liu et al.，2012），因而碳酸鹽巖紅土中的主要粘土礦物即伊利石的形成可能與微生物有關(guān)（李強(qiáng)等，2016）。此外，鐵、錳在自然界中可發(fā)生細(xì)菌介導(dǎo)的氧化、還原（秦松巖等，2008）反應(yīng)，而土壤中錳氧化物被還原的過程往往伴隨著不同類型次生礦物的形成，包括藍(lán)鐵礦（Fe3(PO4)2）、菱鐵礦（FeCO3）等 Fe(Ⅱ)鐵礦物、針鐵礦等 Fe(Ⅲ)礦物和磁鐵礦（Fe3O4）等Fe(Ⅱ)-Fe(Ⅲ)混合的鐵礦物（Borch et al.，2010），進(jìn)而成為碳酸鹽巖紅色風(fēng)化殼中的氧化鐵礦物（朱立軍等，2001）。盡管石灰土來源 于碳酸鹽巖母質(zhì)，但是在氣候、生物、地形、時(shí)間綜合作用下，特別在細(xì)菌的作用下土壤呈現(xiàn)不同的顏色，因此細(xì)菌在巖溶區(qū)黃色石灰土發(fā)育成紅色石灰土過程中可能起著關(guān)鍵作用，這將是今后研究的重點(diǎn)。此外，植被凋落物的分解是植被歸還土壤養(yǎng)分的主要方式，是生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)的重要環(huán)節(jié)。細(xì)菌與真菌作為土壤中物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)的推動(dòng)者可通過分解凋落物起到養(yǎng)分保蓄作用，尤其在0～40 cm土層。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種石灰土細(xì)菌豐度與真菌豐度基本表現(xiàn)為表層土與40 cm以下土層差異顯著，土壤有機(jī)碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)也表現(xiàn)為表層土與40 cm以下土層差異顯著，二者呈極顯著正相關(guān)，由此說明較高的細(xì)菌與真菌豐度有助于促進(jìn)土壤有機(jī)碳積累。

4　結(jié)論

（1）兩種石灰土的微生物豐度受土壤有機(jī)碳、全氮及速效磷等土壤因子影響顯著，土層間土壤因子差異性強(qiáng)于土壤類型，故微生物豐度表現(xiàn)出對(duì)土層的響應(yīng)強(qiáng)于土壤類型。相關(guān)性分析結(jié)果表明，細(xì)菌豐度對(duì)土層養(yǎng)分變化的敏感度高于真菌，說明細(xì)菌豐度在土層間的差異度更適合表征土壤質(zhì)量。

（2）細(xì)菌在真菌的協(xié)同作用下與土層和土壤類型的相關(guān)性更強(qiáng)。細(xì)菌在養(yǎng)分循環(huán)及保蓄方面起了更重要的作用。

致謝：感謝中國(guó)地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)研究所張美良研究員提供石灰土地質(zhì)背景資料及鑒定。

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