痛瀉安腸方對腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠結腸TRPV1表達及血漿SP、CGRP含量的影響

韓亞飛 ，王允亮，郭 一，石 磊，賈博宜，李軍祥*

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院消化內科，北京100078）

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是臨床上常見的功能性胃腸道疾病，以反復發作的腹痛、腹瀉為主要表現，同時可伴有腹脹或腹部膨脹的癥狀[1]。目前，IBS-D的發病機制尚未明確。本研究通過觀察痛瀉安腸方對IBS-D大鼠結腸TRPV1和血清SP、CGRP的影響，初步探討痛瀉安腸方治療IBS-D的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，SPF級，體質量（120±20）g，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2016-0002，飼養在北京中醫藥大學東方醫院動物中心。實驗全程牢牢遵守動物福利的指導準則，即以減少（Reduction）、替代（Replacement）和優化（Refinement）為核心的“3R”原則。

1.2 試劑 痛瀉安腸方水煎劑（炒白術15 g，炮姜9 g，炒白芍12 g，烏梅9 g，蜘蛛香6 g，黃連6 g，蟬蛻6 g，0.5 g生藥/mL）購自北京中醫藥大學東方醫院中藥房，匹維溴銨片（得舒特，法國蘇威特，批號：H20070059）購自北京中醫藥大學東方醫院藥房。乙酸、液體石蠟（北京化學試劑公司）；MEDEX中心靜脈導管（單腔）（美國）；實時熒光定量試劑盒（ 寶生物公司）；總RNA提取試劑、RIPA總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（Sigma公司）；GAPDH鼠單抗、山羊抗兔IgG（H+L）/ HRP（Jackson公司）；SP ELISA Kit、CGRP ELISA Kit（武漢華美公司）；MultiSkan3酶標儀（美國Thermo公司）、ABI7500熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 制備模型前運用隨機數字表法將大鼠分為空白組、模型組、痛瀉安腸方高劑量組（按正常人用標準計量2倍換算）、痛瀉安腸方中劑量組（按正常人用標準計量換算）、痛瀉安腸方低劑量組（按正常人用標準計量1/2倍換算）和匹維溴銨組，每組10只。參照AL-Chaer ED[2]的造模方法，將大鼠倒置，用石蠟將中心靜脈導管潤滑，將0.5% 的冰醋酸經肛門插入距肛緣3～5 cm處，灌注量從0.2 mL開始，逐漸增加至0.7 mL，持續2周。用石蠟將雙腔導尿管球囊端潤滑，經肛門插入距肛緣2～3 cm處，向球囊中充氣1.5～2.0 mL/次，以大鼠出現腹部收縮為度，共擴張3次，同時給予夾尾刺激，持續時間3～5 min，持續2周。在冰醋酸灌腸、球囊直腸刺激聯合夾尾刺激的同時予番瀉葉濃縮劑（0.5 g/mL）灌胃，給藥體積為20 mL/（kg·d），持續4周。

1.3.2 標本采集 末次給藥后，將大鼠禁食禁水24 h，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，抽取大鼠腹主動脈血，靜置后分離血清，分裝- 80 ℃保存。取距離大鼠肛門約8 cm處的結腸組織，放入凍存管內，經生理鹽水沖洗干凈后置于液氮內凍存，之后放入到- 80 ℃冰箱備用。

1.4 指標檢測

1.4.1 內臟敏感性評價 腹壁撤退反射（AWR）評分檢測大鼠內臟敏感性。AWR評分標準[3]：0分，結直腸擴張刺激時大鼠情緒基本穩定；1分，給予刺激時變得開始不穩定，偶爾扭動頭部；2分，給予刺激時腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分，刺激時腹背部肌肉較強烈收縮并出現腹部抬離地面的情況；4分，腹部肌肉強烈收縮，腹部呈弓形，并把腹部、會陰部抬離地面。

1.4.2 糞便 Bristol分級評分 糞便 Bristol分級評分檢測大鼠的腹瀉情況。糞便 Bristol分級評分標準[4]：1型：分散的硬塊，如堅果；2型：臘腸狀，成塊的；3型：臘腸狀，表面有裂縫；4型：臘腸狀或蛇狀，光滑而柔軟；5型： 柔軟團塊，邊緣清楚；6型：絨狀便，邊緣不清，或糊狀糞；7型：水樣糞，無固狀物。

1.4.3 結腸TRPV1和TRPV1 mRNA的檢測 采用Western blot檢測TRPV1的表達。提取蛋白，預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入BSA標準液，檢測樣品蛋白含量；以RIPA調整蛋白濃度，分別加入一抗、二抗，洗膜后進行凝膠圖像分析，得出數值。采用Real-TimePCR檢測TRPV1 mRNA的表達。進行引物設計，提取組織樣本RNA，測定RNA濃度和純度，逆轉錄合成cDNA后再進行PCR擴增，以2-△△ct作為目地基因對數據進行相對定量分析。

1.4.4 血清SP、CGRP的檢測 Elisa測定血清SP和CGRP的表達。將試劑盒平衡至室溫，按試劑盒說明書稀釋標準品，加樣后用洗滌液洗滌4次并拍干，加入HRP標記的二抗，依次加入顯色劑A和B，37 ℃避光反應15～30 min，加入50 μL終止液，450 nm波長下讀取吸光值。

1.5 統計學方法 采用IBM SPSS Statistics 22.0進行統計，計量資料采用均數±標準差（）的形式表示，對符合正態分布且方差齊的數據，其組間差異采用單因素方差分析，不服從正態分布或方差不齊的數據采用非參數檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內臟敏感性評價 見表1。

表1 治療前后各組大鼠AWR評分比較（，n = 10） 分

表1 治療前后各組大鼠AWR評分比較（，n = 10） 分

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.05，△△ P＜0.01

組 別 治療前治療后1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL 1.0 mL 1.5 mL 2.0 mL空白組 0.75±0.27 1.72±0.68 2.95±0.60 0.80±0.19 1.83±0.19 2.92±0.34模型組 1.38±0.61 2.88±0.58## 3.48±0.50 1.33±0.43# 2.92±0.24△△ 3.45±0.45#低劑量組 1.47±0.50# 2.92±0.80## 3.62±0.45# 0.85±0.36△ 2.05±0.39△△ 2.98±0.34△中劑量組 1.50±0.70# 2.55±0.61# 3.38±0.53 1.00±0.34 1.88±0.27△△ 2.95±0.36△高劑量組 1.28±0.51 2.67±0.55# 3.42±0.61 0.90±0.36△ 2.00±0.34△△ 3.08±0.27得舒特組 1.45±0.70# 2.87±0.47## 3.50±0.58 0.93±0.33 2.12±0.55△△ 3.05±0.36

2.2 糞便 Bristol分級評分 見表2。

表2 大鼠糞便Bristol分級評分比較（，n = 10）分

表2 大鼠糞便Bristol分級評分比較（，n = 10）分

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 第28天 第42天空白組 4.58±0.38 4.42±0.38模型組 6.25±0.27## 6.34±0.41##低劑量組 6.33±0.41## 4.50±0.45△△中劑量組 6.17±0.26## 4.75±0.27△△高劑量組 6.17±0.52## 4.58±0.58△△得舒特組 6.42±0.38## 4.67±0.75△△

2.3 結腸TRPV1蛋白和TRPV1 mRNA表達檢測結果 見表3。

表3 大鼠結腸TRPV1蛋白表達灰度值及TRPV1 mRNA的比較 （，n = 6）

表3 大鼠結腸TRPV1蛋白表達灰度值及TRPV1 mRNA的比較 （，n = 6）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組 別 TRPV1/GAPDH TRPV1/2-△△ct空白組 0.98±0.52 1.26±0.26模型組 2.51±0.42# 2.17±0.60##低劑量組 0.61±0.52△△ 1.33±0.15△△中劑量組 0.90±0.82△△ 1.20±0.37△△高劑量組 1.95±0.41 0.90±0.13△△得舒特組 1.96±0.16 1.35±0.15△△

2.4 血清指標的檢測結果 見表4。

表4 各組大鼠血清SP、CGRP的表達比較（，n = 10）

表4 各組大鼠血清SP、CGRP的表達比較（，n = 10）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.05，△△ P＜0.01

組 別 SP CGRP空白組 97.69±8.61 12.31±1.37模型組 124.19±8.06## 14.98±1.67##低劑量組 100.55±10.31△△ 13.03±1.47△中劑量組 97.77±7.32△△ 13.13±0.80△高劑量組 95.73±9.33△△ 12.55±1.83△△得舒特組 101.99±6.55△△ 13.93±1.54△

3 討論

瞬時受體電位香草酸亞型-1（TRPV1）是一種產生痛覺過敏和病理性疼痛傷害性感受分子，在IBS內臟高敏感性發生中具有關鍵作用[5]。研究[6-7]證實，內臟敏感性增加是本病發病的關鍵因素；TRPV1在 IBS患者乙狀結腸的表達較正常人更高，并與患者的腹痛嚴重程度呈正相關。亦有研究[8]發現，感覺神經元TRPV1表達上調與內臟高敏感性疼痛的發生密切相關，是啟動并保持胃腸道高敏感性的重要分子。TRPV1基因敲除可以降低胃腸道傳入神經在擴張刺激下的機械敏感性[9]。SP和CGRP作為感覺神經傳遞介質，廣泛分布于外周以及中樞神經系統。SP 能通過強烈刺激消化道平滑肌，增強胃腸蠕動，產生腹痛或腹部不適癥狀[10]。研究[11]發現，IBS大鼠血漿中SP含量明顯升高，腸道痛閾降低從而出現腸道過敏。CGRP能夠調節胃腸分泌和運動功能，加快結腸的蠕動，導致腹痛、腸鳴及腹瀉等臨床癥狀[12]。研究[13]顯示，血漿CGRP水平在IBS 發病中發揮著重要作用，提示CGRP的升高與內臟高敏感性密切相關。

痛瀉安腸方是導師李軍祥教授經過多年臨床總結的臨床經驗方，在IBS-D的治療中取得了顯著的療效。方中白術苦甘而溫，補脾燥濕以治土虛，為君藥；炮姜性溫，善暖脾胃，能溫中止痛止瀉，與白術共為君藥。白芍酸寒，柔肝緩急止痛，與白術相配，收健脾止瀉之功；味酸入肝，與白芍相配則加強柔肝止痛之力，與白芍共為臣藥。蜘蛛香辛苦而溫，理氣中瀉木；烏梅酸澀性平，能澀腸止瀉，與白術相配以止痛，除濕止瀉；黃連清熱燥濕，厚腸止瀉；蟬蛻氣味甘寒，乃清虛之品，能祛風而勝濕，與黃連相配，防止濕邪入里化熱，與蜘蛛香、黃連共為佐藥。諸藥相伍，是仿痛瀉要方之義，使脾健肝舒，氣機調暢，痛瀉自止[14]。

本研究顯示，IBS-D大鼠內臟敏感性閾值下降，糞便含水量和糞便Bristol分級評分均明顯升高，結腸組織TRPV1蛋白表達升高，結腸TRPV1 mRNA表達升高，血清SP、CGRP水平升高；痛瀉安腸方治療后內臟敏感性閾值升高，大鼠糞便含水量和糞便Bristol分級評分降低，且接近空白組，結腸組織TRPV1蛋白表達下降， TRPV1 mRNA表達降低，血清SP、CGRP水平下降，說明痛瀉安腸方能上調內臟敏感性閾值，下調結腸組織TRPV1蛋白表達，降低結腸TRPV1 mRNA的表達，降低血清SP、CGRP水平，達到治療IBS-D的目的。

但是，實驗結果顯示，高劑量組和得舒特組大鼠結腸組織中TRPV1蛋白和TRPV1 mRNA的表達并不完全一致，其中TRPV1蛋白在治療前后并未發生明顯改變，腸道功能的變化是否主要體現在蛋白的表達上以及基因是否參與腸道功能的變化仍需進一步驗證，TRPV1蛋白的表達是否與和TRPV1 mRNA的表達同步尚需進一步研究。

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