電針深刺對三叉神經痛大鼠三叉神經節中P2Y2受體及Kv3.4表達的影響

李崖雪，高瑞雪，劉 瀟*，王 豐，李曉陵，閆禹竹，王欣波，孫士紅，任佰亮

（1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040）

原發性三叉神經痛(TN)是最痛苦、難治疾病之一，發病率接近 4.5/100 000，老年女性多發[1-2]。目前，中樞病因學說認為TN的發病為癲癇樣改變，周圍學說認為是該神經脫髓鞘改變[3]。在三叉神經節神經元中存在P2Y2 受體，激活P2Y2受體通過抑制Kv通道亞型表達增強TG神經元興奮性，引起大鼠顏面病理性疼痛[4]，本研究通過運用電針配合深刺下關穴方法降低大鼠三叉神經節神經元中P2Y2受體表達情況并增加Kv3.4 mRNA表達而達到止痛目的。

1 材料與方法

1.1 動物 SD成年雄性大鼠，體質量（250±50）g由黑龍江中醫藥大學動物實驗中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 5-0可吸收鉻腸線（上海醫療器械有限公司），小鼠來源的大鼠β-actin單克隆抗體（Cell signal technique公司），多克隆兔抗大鼠P2Y2（Santa Cruz 公司）；E831型電泳儀（Consort公司比利時），Western Blot轉膜系統及垂直電泳(Bio-Rad公司美國），羊抗大鼠Kv3.4（Santa Cruz公司），PTPCR儀（CORBETTRESEARCH澳大利亞公司)。

1.3 模型制備 對SD大鼠進行腹腔麻醉后俯臥位固定，局部消毒，鏡下做右眉弓上弧形切口，暴露出眼眶，撥開內容物，暴露出眶下神經，從近向遠分離眶下神經。用2根鉻線結扎神經，間距2 mm。壓迫力度：纖維鏡下可見神經略微變細，不全阻斷神經傳導，保持神經外膜血液通暢。待動物醒后進行觀察（通常于術后14 d成模），模型成功率70%。

1.4 模型成立標準 14 d后操作員持刺激棒對大鼠患側面部進行刺激，如出現：大鼠患側面部避免被接觸，快速后退，或表現將頭面藏于身下，躲避刺激或團起身子向籠壁靠攏，大鼠快速抓咬刺激物的攻擊行為，非對稱性面部搔抓至少連續3次中的任意1項或l項以上即模型成立。

1.5 分組及治療方法 選用成年雄性SD大鼠30只，隨機分為3組，各10只。電針組（電針配合深刺下關穴治療組）：14 d后（模型成立）即開始對大鼠治療，采用不銹鋼毫針，規格：0.18 mm×13 mm（上海真康醫療公司）；右側下關穴進行直刺，深度約5 mm（盡量接近三叉神經半月節處），向后平刺百會穴，深度約3 mm；連接電針治療儀，正極連接百會穴，負極連接下關穴，選擇波形：輸出頻率80 Hz/s連續波，電針20 min，再留針10 min后拔針，2次/d，14 d為1療程。假手術組：切開皮膚暴露神經，不結扎神經，縫合右側眶部皮膚后觀察。模型組：切開皮膚暴露神經，結扎神經，制備大鼠TN模型。

1.6 痛閾測定 用BME-403型細絲法檢測儀從小到大逐漸增加折力，對大鼠觸須及周圍皮膚進行刺激，各強度需要刺激6次，取平均值確定大鼠痛閾。當強度大于20.1g時，大鼠未出現疼痛反應，痛閾即可以定為20.1g。對各組大鼠痛閾進行統計比較。

1.7 Western Blot方法檢測P2Y2受體 用PBS洗滌培養后的三叉神經半月節,加入細胞裂解液，進行裂解細胞，刮下細胞后，收集于微量離心管中，5～10 min沸水浴， 12 000 r/min離心10 min。取上清，測定蛋白含量（Bradford法）。樣品每種取蛋白50 μg，加入上樣緩沖液后進行不連續SDS-PAGE（濃縮膠60g/L，分離膠100g/L）。泳畢，把蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，滴加BSA（10 g/L）封閉，依次滴加一抗（多克隆兔抗大鼠P2Y2 ，濃度1:1 000）及二抗（標記的羊抗兔IgG，1:3 000 HRP），室溫下分別作用1、2 h。然后進行洗膜，之后用化學發光法ECL進行檢測，程序為將X線片先顯影2～20 min，進行定影，再通過圖像分析軟件Image tool讀取在X線膠片上測得目的條帶的光密度值，然后檢測β-actin條帶的光密度值，以此做參考標化各組P2Y2蛋白表達量。

1.8 實時定量PCR檢測Kv3.4 mRNA表達情況 提取三叉神經節RNA，取總RNA 1 μg為模板，以β-actin做為內參，進行檢測。擴增條件：先95 ℃預變性，然后持續5 min進入30個循環，72 ℃7 min延伸；β-actin擴增條件：先95 ℃預變性，在4 min后進行32個循環，10 min 72 ℃延伸。擴增產物進行電泳。采用凝膠成像系統對目的電泳條帶進行讀取，將3組Kv3.4的灰度值標化，進行比較。

1.9 統計學方法 用SPSS 17. 0統計分析，數據用均數±標準差（）表示，各組數據比較采用方差分析，P＜0.05為有差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組痛閾比較 見表1。

表 1 3組痛閾比較（，n = 10）

表 1 3組痛閾比較（，n = 10）

注：與模型組比較，# P＜0.05

組 別 術后14 d 術后28 d假手術組 10.22±3.46 # 11.56±2.36#針刺組 1.46±0.25 10.36±2.88#模型組 1.02±0.04 3.44 ±1.65

2.2 3組大鼠三叉神經節神經元P2Y2受體蛋白表達情況 模型成立后（術后14 d），假手術后14 d及電針深刺治療14 d（術后28 d）后，Western blot方法測定大鼠三叉神經節中 P2Y2受體的表達。經電針深刺法治療后三叉神經痛大鼠TG中P2Y2受體的表達顯著下降，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），與假手術組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 3組大鼠三叉神經節中 Kv3.4 mRNA的表達情況 模型成立后（術后14 d），假手術后14 d及電針深刺治療14 d（術后28 d）后，采用實時定量PCR測定大鼠三叉神經節中 Kv3.4 mRNA的表達。經電針深刺法治療后三叉神經痛大鼠TG中Kv3.4 mRNA表達顯著增加，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），與假手術組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

三叉神經痛，針灸選穴上常以局部選穴為主或按分支選穴[5]，存在誘發三叉神經痛發作的弊端[6]，本研究顏面只取一個遠離疼痛部位的下關穴[7]，與總督一身陽氣的百會穴[8]相配，既不會誘發疼痛又起到疏調顏面陽經經氣作用，達到經脈通則不痛的目的。配合電針波形中密波以充分達到鎮痛作用[9-10]。

同時下關穴深刺盡量接近三叉神經半月節，在三叉神經節神經元中存在P2Y2受體。 P2Y2受體在體內廣泛分布，激活后具有顯著病理生理效應[11]。P2Y2受體下調（可以通過該受體抑制劑）對傳遞疼痛信號起到抑制作用，從而終止疼痛[12]。而三叉神經痛發病機制正是由于某種損傷激活TG上P2Y2受體，進而抑制Kv通道亞型表達增強TG神經元興奮性，引起大鼠顏面病理性疼痛[4]。本研究通過運用電針配合深刺[13]下關穴方法盡量接近并刺激大鼠三叉神經節，降低大鼠三叉神經節神經元中P2Y2受體表達情況。同時電壓門控性鉀通道亦受到TG上P2Y2受體的調節，進一步促使神經末梢中神經遞質釋放[14]。通過研究，在TN發作時IA起作用最明，IA的Kv通道亞型主要是Kv3.4等。本實驗結果顯示，電針深刺法治療后三叉神經痛大鼠疼痛程度明顯減輕，TG中P2Y2受體的表達顯著下降、Kv3.4 mRNA表達顯著增加，與模型組比較，P＜0.05，與假手術組比較，P＞0.05。結論：此法可以通過降低P2Y2受體表達同時增加Kv3.4 mRNA表達，抑制神經元興奮性而起到鎮痛作用。

參考文獻：

[1]劉培慧,劉佳妹,孫曉紅.原發性三叉神經痛的發病機制及治療進展[J].山西醫藥雜志, 2015, 58(6):1373-1376.

[2]曾明慧,傅先明,姜曉峰.原發性三叉神經痛發病機制研究進展[J].臨床神經外科雜志, 2012,13(2):55-57.

[3]姜濤,馬林.三叉神經痛病因、病理、發病機制研究進展及影像學的重要作用[J].中國醫學影像學雜志, 2015,22(6):312-316.

[4]李娜.P2Y2受體對大鼠三叉神經節神經元介導瞬時外向鉀電流的電壓門控性鉀通道的抑制作用研究[D].上海:中國人民解放軍第二軍醫大學, 2012.

[5]劉征,王海燕,馬莉.近5年中西醫治療三叉神經痛研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報, 2017, 18(4):90-93.

[6]黃壯,霍金,趙冏琪.齊刺電針扳機點治療原發性三叉神經痛療效觀察[J].中國針灸, 2017, 36(1):31-34.

[7]陳裕彬,粟璇,杜淑佳,等.下關穴透刺療法對原發性三叉神經痛患者疼痛及睡眠質量的影響[J].云南中醫中藥雜志,2017, 37(1):67-69.

[8]程為平,韋燕博,張茜茹.論百會穴穴性及臨床應用[J].遼寧中醫藥大學學報, 2015, 16(3):123-124.

[9]師帥,李雪巖,蔡玉梅.電針密波治療伴面肌痙攣的特發性面神經麻痹60例臨床觀察[J].中醫藥學報, 2015, 42(4):81-83.

[10]周杰,陳勤,梁宜.電針治療神經病理性疼痛的系統評價[J].中國現代醫生, 2017, 10(2):116-120,124.

[11]于亞東,郭清,洪光祥,等.大鼠嘌呤P2Y2受體在神經系統分布的實驗研究[J].中國修復重建外科雜志, 2005,18(11):156-158.

[12]柴松嶺,高璐,張福胤.P2Y及P2Y2受體的研究進展[J].中外醫療, 2009, 28(5):169-171.

[13]吳虹輝.深刺法治療腰椎間盤突出癥100例觀察[J].實用中醫藥雜志, 2013, 28(12):1047.

[14]張潔,李偉敏,邢巖.原發性三叉神經痛神經纖維受損的研究[J].現代電生理學雜志, 2017, 19(1):15-17.