異育銀鯽中鯉皰疹病毒Ⅱ型載量測定方法的建立

李雙 ，吳霆 ，2，顧偉 ，孟慶國 ，王文

（1.南京師范大學生命科學學院，江蘇省水生甲殼動物病害重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.寶應縣水生動物疫病預防控制中心，江蘇 寶應 225800）

1 引言

鯽魚是我國重要的淡水養殖魚類之一[1]，其分布廣，肉質鮮美，營養豐富，一直受到我國消費者的青睞，具有重要的經濟價值，養殖規模不斷擴大，近幾年來，鯽魚呈現出越來越大的養殖潛力。據統計，2012年我國養殖鯽產量已達340多萬噸，在我國淡水養殖中占有十分重要的地位[2]，而異育銀鯽是中國科學院水生生物研究所培育出來的鯽魚的一個品種[3-4]，具有個頭大、出肉率及成活率高[5-6]、肉質鮮美、營養豐富等特點，越來越受到廣大養殖戶的喜愛，其產量持續增長，并帶來了巨大的經濟效益和社會效益。

然而，大規模病害的爆發阻礙了異育銀鯽養殖業的發展，如寄生蟲病、細菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病等。2012年來，異育銀鯽養殖區出現了越來越嚴重的鰓出血性疾病，造成了大規模的死亡，帶來了嚴重的經濟損失，經鑒定引起這種疾病的是鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2），引起了廣泛研究者的研究興趣。CyHV-2最早于1992年在日本的金魚中被發現[7，10]，稱為“金魚皰疹病毒性造血器官壞死癥”，將該病毒稱“金魚造血器官壞死病毒”(Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)[7，10]。2012年中國江蘇出現的CyHV-2是第二個從鯉科魚中分離出的病毒，國際病毒系統分類與命名委員會命名其為鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpes virusⅡ，Cy－HV-2)[8-9]，因其可造成鯽魚造血組織器官壞死，所以又稱該病毒為“皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒”，(Herpes viral haematopoietic necrosis virus，HVHNV)[9,25－26]。鯉科魚皰疹病毒目前分為三個型，分別為鯉痘瘡病毒 （Carp pox herpes virus，Cyprinid herpes virus，CyHV-1）；鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）及錦鯉皰疹病毒（Koi herpes virus，Cyprinid herpes virus 3，CyHV-3）。CyHV-2與CyHV-3關系較近，而與CyHV-1關系較遠[9-10]；CyHV-2核衣殼呈六邊形，直徑為100～110 nm；CyHV-2病毒具有囊膜，呈橢圓形，直徑為 175～200 nm[11-12]。CyHV-2具有高致病性，病死率可達90%～100%，主要感染金魚，鯽魚及其變種，不感染鯉魚和錦鯉。該病發病水溫范圍為15～32 ℃，流行高峰為20～28℃[13-14]。魚發病時表現的病癥為活動緩慢，不活潑，鰓部和鰭基部有出血點，魚鰾有出血斑點，尾鰭末端發白等。

目前對該病毒的檢測方法主要有普通PCR[15]、巢式 PCR[16]、環介導等溫擴增[17-18]、電鏡觀察[19]、細胞培養分離法[20]等。實時熒光定量PCR技術具有靈敏度高、特異性好、快速準確方便等優點，既能定性檢測也能夠定量檢測，在水生病原微生物的檢測中得到了廣泛的應用。定量檢測異育銀鯽體內的CyHV-2有基于TaqMAN探針方法的熒光定量PCR方法的建立，但是沒有基于SYBR Green法建立的熒光定量PCR檢測方法，且利用熒光定量PCR來研究CyHV-2在魚體內組織器官分布的報道還是一片空白?；赟YBR Green法簡單快捷等特點，本文建立了SYBR Green法實時熒光定量PCR定量方法，并研究了魚體內各個器官的病毒載量，體現了不同器官CyHV-2的分布情況，為該病毒的免疫學研究提供了數據和奠定了研究基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗魚和病毒來源

2.1.1 實驗健康魚 試驗用健康100尾異育銀鯽來自于江蘇省寶應縣沒有發病史的養殖塘口，Cy－HV-2 PCR檢測陰性，體質量為280～400 g，養殖在紫外殺菌水控溫增氧循環水養殖系統（上海海圣）中，溫度控制在26～28℃，在處理前先暫時養殖1周。

2.1.2 病毒來源 CyHV-2病毒由江蘇省寶應縣具有明顯出血病發病癥狀、且CyHV-2 PCR檢測陽性的異育銀鯽體內分離得到，病魚來自江蘇寶應縣養殖戶發病塘口，發病當天將這些垂死新鮮病魚收集起來用于病毒液的提取。

2.2 生物實驗試劑

PBS配方：磷酸緩沖液PBS(pH 7.5)100 mL A液：2.53%NaH2PO4·2H2O 83 mL；B 液：2.52%NaOH 17 mL。

5%chelex-100配方：稱取5 g chelex-100固體顆粒放入100 mL ddH2O中，混勻，放于4℃冰箱保存。

Chelex-100、protease K、2 000 DNA Marker、2×EasyTay PCR Super Mix、滅菌雙蒸水等均購自南京百斯凱生物公司。SYBR premix Ex TaqⅡ購自Takara公司。RNAfree水購自北京全式金生物公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 病毒的分離與純化 用75%酒精消毒病魚，解剖后取病魚的腎臟、鰓，放在勻漿器里，然后加5 mL PBS在冰上研磨3～5 min；將研磨液倒入50 mL離心管中放入離心機中4 000 r/min室溫離心10 min；將上清液轉移至另一支新的50 mL離心管中；在超凈工作臺中純化病毒粗提液，先用1 mL PBS潤濕0.22 μm濾器，然后病毒粗提液經0.22 μm濾器后過濾至新的50 mL離心管中；將過濾的病毒液分裝在1.5 mL的離心管中放4℃保存備用。

2.3.2 病毒回感和病魚組織的獲取 取兩支病毒液1 mL，每尾健康魚進行胸鰭注射100 μL，共回感20尾，之后每天觀察魚的發病特征和有無死亡。取有典型發病癥狀魚的腎、鰓、脾、肝、腸、肌肉和卵，用于DNA的提取。

2.3.3 DNA的提取 將獲取的組織（0.1～0.5 g）放入1.5 mL離心管中，然后用牙簽攪碎成勻漿狀；加入200 μL 5%chelex和20 μL蛋白酶K至組織勻漿液，旋渦儀振蕩混勻，56℃水浴鍋中水浴20 min，用漩渦器振蕩混勻后再99℃水浴鍋水浴8 min；之后4 ℃，12 000 r/min，離心 4 min，之后取上清，用移液槍輕輕轉移到另一新離心管中即為DNA粗提液，標記好后置于-20℃保存備用。

2.3.4 普通PCR檢測

2.3.4.1 引物設計 引物設計參考文獻設計和合成引物：

CyHVpol-F:5'-CCCAGCAACATGTGC-GACGG-3'；

CyHVpol-R:5'-CCGTARTGA-GAGTTGGCGCA-3'。

擴增CyHV-2特異性聚合酶基因362 bp片段。

2.3.4.2 PCR擴增體系 上下游引物1μL，2×Easy－Tay PCR Super Mix 12.5 μL，滅菌雙蒸水 10 μl，DNA 模板 0.5 μL，總共 25μL，混勻。

2.3.4.3 PCR擴增程序 PCR反應程序為：94℃預變性 3 min；94℃變性 3 s、56 ℃退火 15 s、72℃延伸10 s，35次循環；72℃延伸10 min；4℃保溫。

2.3.4.4 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL PCR產物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠，120 V，25 min，并在紫外燈下查看擴增效果，檢測有無目的基因片段的擴增。

2.3.5 熒光定量PCR

2.3.5.1 引物設計 利用Primer 5設計引物如下：

CyHV-16-QF:5'-TTACTGGAGGTCGGTGAAGG-3'；

CyHV-16-QR:5'-CGTCTGGAAAGCGTGTGACT-3'。

2.3.5.2 實時熒光定量PCR體系 熒光定量PCR體系共 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，SYBR Green核酸染料加 5μL，RNA free H2O 3.2 μL，DNA 模板1 μL。

2.3.5.3 實時熒光定量PCR反應程序 預變性：95℃，5 min；擴增 40個循環：95 ℃，10 s，60 ℃，30 s；溶解曲線：95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s。

3 實驗結果

3.1 普通PCR檢測結果

在實驗前，為了保證實驗順利進行，在給健康魚注射病毒前，對用于提取病毒液的4條垂死病魚的腎組織進行了普通PCR檢測，看這些病魚是否真正的感染上病毒，得到的結果如下圖1，可以看到這4條魚的檢測結果中，4條病魚的腎組織皆為陽性。總之，這些病魚提取的病毒液可以放心用于人工回感。另外，回感過后也對提取的病毒液進行了PCR檢測，結果也呈陽性。

圖1用于提取病毒液的病魚組織PCR結果

3.2 疾病感染癥狀

圖2異育銀鯽人工感染鯉皰疹病毒Ⅱ型后的疾病癥狀和健康魚的對比（A：感染3d后有明顯病癥的病魚；B：健康魚作為對照）

與正常魚相比，回感的魚出現行動緩慢等反應。從第2天開始魚出現了輕微病癥，第3天開始出現死亡，都有明顯的病癥：鰭基部有出血點、尾鰭末端發白、眼球突出、行動緩慢等，第7天90%回感魚死亡。

3.3 溶解曲線

在real-time PCR擴增40個循環后，進行了溶解曲線分析，表明該引物的的特異性較強。由得到的溶解曲線可以看出CyHV-2的溶解溫度為84.5℃（如圖3）。而陰性對照沒有擴增信號。

圖3 CyHV-2 real-time PCR擴增40個循環后產物的溶解曲線

3.4 熒光定量PCR標準曲線的繪制

將獲取的DNA模板測定濃度后，10倍梯度稀釋，分別以 6.07×108～6.07×102copies/L 為模板，進行熒光定量PCR檢測，檢測結果見表1、圖4，計算并得出標準曲線：y=-3.6399x+36.941，R2=0.9998。3.5 QRT-PCR檢測CyHV-16的組織分布

表1熒光定量PCR標準曲線繪制相關數值

圖4熒光定量PCR標準曲線.橫坐標為CyHV-16基因拷貝數的對數值；縱坐標為起始擴增的循環數

QRT-PCR檢測CyHV-16在發病異育銀鯽各個組織的表達分布，圖5結果顯示CyHV-16幾乎分布在被感染的異育銀鯽的各個組織和器官，如脾臟、腎臟、鰓、肝臟、腸道和肌肉組織等，但是卵巢中未檢測到。其中CyHV-16在脾臟組織中表達量最高，在腎、肝臟和鰓中次之，肌肉組織中表達量較少。

圖5 QRT-PCR檢測CyHV-16在不同組織中的表達分布差異分析

4 討論

鯽魚是我國重要的淡水養殖品種，而異育銀鯽因其生長快速，食性雜，易飼養，含肉率高，味道鮮美，營養價值高而廣受消費者的青睞，對我國淡水養殖業的發展起著重要的作用，而疾病對其造成了一定的經濟損失，因此，對異育銀鯽病害的防治對淡水養殖業的越來越好的發展至關重要。CyHV-2是目前危害異育銀鯽養殖業最大的病原，可造成100%的病死率，因此，建立一種CyHV-2定量檢測技術對于有效預防控制該病毒具有重要的意義。

目前對病毒的檢測方法中，應用最為廣泛的是PCR檢測。Goodwin等基于CyHV-2聚合酶基因建立的PCR方法將取自美國患鯉皰疹病毒Ⅱ型病的金魚組織中提取的DNA擴增出目的基因片段，且目的基因序列與Waltzek等[11]報道的CyHV-2基因序列也有99%以上的一致性。薛忠儀等[8]建立了一種快速檢測CyHV-2的PCR檢測方法，該方法運用Chelex-100這一離子螯合劑快速粗提組織DNA[8]，該方法提取快速簡單，大大縮短了提取時間，僅僅需要1 h內就可完成實驗，大大提高了CyHV-2檢測的效率。但是該方法只能粗略的檢測組織中有無CyHV-2，卻無法定量病毒數的多少。于力等[12]人建立的Taqman實時熒光PCR方法，他們依據CyHV-2的主要衣殼蛋白MCP基因，不僅設計了普通PCR引物，還設計了Taqman熒光探針引物，比較繁瑣，而且他們對所有病魚組織混在一塊提取DNA，只是對該病毒與其他病原菌做對比，進行特異性和靈敏性驗證，并不能看出病魚各個組織中該病毒的分布情況；周勇等[21]雖然建立了Taqman實時熒光PCR定量CyHV－2的方法，是試驗中合成探針引物，過程較復雜，并且沒有進一步研究CyHV-2在各組織的分布情況。而本文建立的Realtime PCR方法（SYBR Green法）在快速提取DNA的基礎上進行了改良，簡單快速，不需要設計合成探針引物等優點，不僅能夠定性檢測，而且可以定量病毒載量的多少，是一種即快速準確又能定量各個組織內病毒拷貝數的有效的檢測方法，在此基礎上本文還調查了各組織中該病毒的不同分布。

綜上可知，本研究基于Chelex-100快速提取核酸的基礎上，建立了快速靈敏高效的Realtime PCR方法（SYBR Green法），可以定量異育銀鯽體內Cy－HV-2拷貝數，這對以后研究該病毒的致病機理提供了一定的數據參考，為以后有效地預防和控制該病奠定了基礎。

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