不同蒙藥對(duì)牛源致病性大腸桿菌體外抑菌效果的篩選

郭雪梅 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 010018

王純潔 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 010018

斯木吉德 阿日查 張 劍 敖日格樂 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 010018

賀志英 內(nèi)蒙古烏蘭察布市卓資縣獸醫(yī)站 012300

大腸桿菌病是由某些血清型菌株引起的一類疾病的總稱[1]。致病性大腸桿菌不僅是全球性腹瀉的主要病因，而且可導(dǎo)致出血性結(jié)腸炎等多種疾病。大腸桿菌的致病性與其侵襲的方法、途徑、毒力、數(shù)量和種類有關(guān)。不同菌株由于感染體的途徑或病原體的毒力和數(shù)量不同，導(dǎo)致病原體侵入機(jī)體后所造成的感染類型不相同。致病性大腸桿菌的毒力因子包括黏附素、毒素和外膜蛋白等，這些毒力因子相互協(xié)調(diào)，導(dǎo)致宿主入侵后機(jī)體免疫力低下，引起多種疾病[3]。

隨著抗生素、化學(xué)合成藥和促生長(zhǎng)劑等藥物在養(yǎng)殖業(yè)上的廣泛應(yīng)用，越來越多的病原菌產(chǎn)生了耐藥性，而且耐藥性也發(fā)生了轉(zhuǎn)移，同時(shí)由于藥物的毒副作用，藥物殘留導(dǎo)致的畜產(chǎn)品安全問題也愈來愈突出。我國(guó)傳統(tǒng)中草藥在防治細(xì)菌性疾病方面積累了許多寶貴經(jīng)驗(yàn)，君臣佐使配合，互相協(xié)調(diào)作用，即可達(dá)到補(bǔ)氣升陽(yáng)、扶正祛邪和標(biāo)本兼治的治療效果。黃芩、大黃、蒲公英等多味中草藥的抗菌活性較強(qiáng)，可以作為治療大腸桿菌病的首選藥。另外有研究表明，生物制劑治療法和大蒜素治療法對(duì)大腸桿菌病的治療也有一定的療效[6]。因此,本研究通過9味蒙藥對(duì)致病性E.coli O78進(jìn)行了體外抑菌作用的測(cè)定，篩選出抑菌作用良好的菌株，旨在為對(duì)大腸桿菌病的預(yù)防和治療提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

（1）試驗(yàn)藥品。黃連、甘松、瞿麥、草烏葉、黑云香、姜黃、柯子、大黃和多葉棘豆等9味蒙藥均購(gòu)自內(nèi)蒙古京遠(yuǎn)大藥房。

（2）供試菌株。牛源致病性E.coli O78由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院牛生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，從呼和浩特周邊地區(qū)荷斯坦奶牛直腸糞便中提取出來。

（3）試驗(yàn)試劑。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；NaOH、HCL、蒸餾水、生理鹽水、TTC溶液配制（0.01gTTC購(gòu)自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，0.04g琥珀酸鈉用2mL生理鹽水混勻）。

（4）試驗(yàn)材料。10mL離心管、96孔板、涂布棒、移菌槍、玻璃培養(yǎng)皿、槍頭、移液槍 （1000uL、10uL和200uL）、酒精燈、三角瓶、燒杯和量筒。

（5）試驗(yàn)儀器。YXQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；D2-1萬用電爐，購(gòu)自北京中興偉業(yè)儀器有限公司；YC-2602醫(yī)用冷藏箱，購(gòu)自中科美麥低溫科技有限責(zé)任公司；SW-CJ-20雙人單面垂直送風(fēng)凈化工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州泊萊爾凈化設(shè)備有限公司；Y1-LRH-400-d生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；76新銳可見分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

2 試驗(yàn)方法

（1）藥液制備。分別稱取黃連、甘松、瞿麥、草烏葉、黑云香、姜黃、柯子、大黃和多葉棘豆各50g放入紗布包中，置于500mL蒸餾水室溫浸泡過夜，煮沸1.5小時(shí)，過濾藥液。濾渣加205mL水，煮沸1小時(shí)過濾。2次藥液小火濃縮至50mL（即藥液中所含生藥量為1g/mL），121℃滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）E.coli O78菌液制備。將實(shí)驗(yàn)室保存的牛源致病性E.coli O78在營(yíng)養(yǎng)肉湯-麥康凱瓊脂-伊紅美蘭瓊脂-營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)后，接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中恒溫?fù)u床中，110r/分鐘，37℃培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期[9]。采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌數(shù)，將菌液渦旋震蕩混勻，取10mL用生理鹽水10倍稀釋10個(gè)梯度，每個(gè)梯度吸取100uL菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂板上，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。選取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的瓊脂板取平均值進(jìn)行計(jì)數(shù)。吸取10mL菌液，經(jīng)過5000r/分鐘離心10分鐘，棄上清，留沉淀。用高壓滅菌的生理鹽水洗滌3次，最后用無菌生理鹽水菌液濃度調(diào)整為1×107 CFU/mL備用。

（3）小鼠致病性的試驗(yàn)。選取20±2g的昆明系小鼠，雌雄各半，設(shè)置對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組10只，分別腹腔注射0.3mL無菌生理鹽水和牛源致病性E.coli O7810倍稀釋液，72小時(shí)內(nèi)觀察牛源致病性E.coli O78對(duì)小鼠的致死率。

（4）抑菌圈的測(cè)定。將致病性E.coli O78菌液調(diào)整為1×107 CFU/mL，用涂布棒均勻地涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1小時(shí)，用滅菌的小懾子夾起滅菌好的牛津杯放到涂布好的培養(yǎng)基上，加入200uL藥液，重復(fù)3次，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時(shí)后觀察，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。直徑大于15mm為極度敏感，大于10mm、小于15mm為高度極敏，大于8mm、小于10mm為敏感，小于8mm為不敏感[8]。

（5）最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定。采用二倍稀釋法，將甘松 、瞿麥、草烏葉、黑云香、姜黃、柯子、大黃和多葉棘豆用肉湯依次2倍稀釋，分別稀釋11個(gè)梯度，加入96孔板的前11孔中，每孔加200uL，隨后接入50uL對(duì)數(shù)期E.coli O78菌液，菌數(shù)為1×107 CFU/mL。第12孔加入200uL肉湯和50uL純菌液作為空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)18小時(shí)后，加入5uL配好的TTC，2小時(shí)后觀察顏色變化。試驗(yàn)組加入染色劑后，沒有被染為紅色的最低藥物濃度即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

3 結(jié)果與分析

（1）小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)組小鼠在腹腔注射致病性E.coli O78后72小時(shí)內(nèi)全部死亡，空白組小鼠全部健活；小鼠注射致病性E.coli O78后可見昏睡、厭食和被毛蓬松，少數(shù)可見黃色拉稀和嘴鼻流出黃色液體。迅速剖檢死亡小鼠，可見胸腔和腹腔內(nèi)有大量黏液滲出；腸道發(fā)生腫脹，腸腔內(nèi)充滿腥臭、黃色稀薄的內(nèi)容物；肝臟、脾臟和腎臟腫大，肝表面及切面出現(xiàn)灰白色的壞死灶；肺腫脹、充血、水腫。

（2）體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果。黃連的抑菌作用最好，抑菌直徑平均值為18.6mm，表現(xiàn)為極敏，其中最大值達(dá)到了22.0mm；其次為甘松、草烏葉、大黃和瞿麥，抑菌直徑分別為14.0mm、13.8mm、13.2mm和12.4mm,均表現(xiàn)為高敏；姜黃的抑菌直徑為7.6mm，表現(xiàn)為不敏；多葉棘豆和柯子沒有抑菌圈產(chǎn)生。

不同蒙藥對(duì)致病性E.coli O78的MIC測(cè)定結(jié)果，黃連的MIC最低為0.0039g/mL，其次為大黃和甘松，MIC分別為0.0625g/mL和0.125g/mL，瞿麥、草烏葉、姜黃的MIC為0.25g/mL，黑云香的MIC為0.5g/mL，而柯子和多葉棘豆沒有MIC的產(chǎn)生。表明除柯子和多葉棘豆外，其余7味蒙藥都對(duì)致病性E.coli O78有不同程度的抑菌作用，黃連和大黃的抑菌效果較好。

4 討論

我國(guó)的草藥資源相當(dāng)豐富,人們對(duì)中成藥的療效和安全性都比較信任，所以草藥市場(chǎng)的開發(fā)空間十分廣闊。但是目前對(duì)草藥抗菌活性的研究仍處于探索階段，蒙藥方面更是鮮有報(bào)道。關(guān)于中草藥體外抑菌的研究有許多報(bào)道，常用的抑菌研究方法有紙片法和杯碟法，這些方法大多是定性分析而非定量分析。紙片法和杯碟法的優(yōu)點(diǎn)是在一個(gè)瓊脂平板上可同時(shí)進(jìn)行多種藥物或多種濃度的同一種藥物的試驗(yàn),缺點(diǎn)是藥物濃度不一，即定量測(cè)定不準(zhǔn)。紙片法雖然簡(jiǎn)易操作,但是藥液成分復(fù)雜,藥量的準(zhǔn)確性很難控制,敏感度較低。而牛津杯法可定性反映致病菌對(duì)藥物的敏感程度。微量稀釋法不但能夠定量測(cè)定藥物對(duì)病原菌的最小抑菌濃度，還可以直觀反映細(xì)菌在藥物作用下的生長(zhǎng)狀況[10]。鑒于此,本試驗(yàn)采取牛津杯法和2倍稀釋法對(duì)9味不同蒙藥對(duì)致病性E.coli O78的體外抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定。將兩種抑菌試驗(yàn)方法相結(jié)合，避免了單獨(dú)采用一種方法造成試驗(yàn)結(jié)果的片面性[11]。

不同蒙藥對(duì)大腸桿菌的抑菌圈和MIC均有不同，試驗(yàn)中9味蒙藥體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示,只有黃連對(duì)致病性E.coli O78抑菌圈表現(xiàn)為極敏，MIC最低；甘松、草烏葉、大黃和瞿麥對(duì)致病性E.coli O78的抑菌直徑表現(xiàn)為高敏，柯子、多葉棘豆既沒有抑菌圈的產(chǎn)生也沒有MIC的產(chǎn)生。其中大黃抑菌圈直徑小于甘松和草烏葉，但MIC卻低于兩者，猜測(cè)出現(xiàn)這種差異的原因主要與單味藥的成分有關(guān)，不同藥物的體外抑菌作用存在一定差異，所使用的藥物源、質(zhì)量和提取方法都與抑菌試驗(yàn)結(jié)果有關(guān)[12]。

5 結(jié)論

將牛津杯法與二倍稀釋法聯(lián)合使用，有效地篩選出9味蒙藥中黃連對(duì)致病性E.coli O78的抑菌效果最好，其次為大黃、甘松、草烏葉和瞿麥，而柯子和多葉棘豆對(duì)致病性E.coli O78沒有抑菌作用。表明蒙藥在細(xì)菌性疾病防治方面有巨大的開發(fā)潛力，可以為蒙藥的開發(fā)和利用提供更為科學(xué)的理論依據(jù)。