枯草芽孢桿菌β-BS01誘變株對東北溫室常見真菌病害的抑制

王相玉，胡貿英，吳云飛，李 嵐，任國莉*

?

枯草芽孢桿菌β-BS01誘變株對東北溫室常見真菌病害的抑制

王相玉1，胡貿英2，吳云飛2，李 嵐1，任國莉2*

(1. 佳木斯大學 理學院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學 農業與環境生物技術研究所，黑龍江 佳木斯 154007)

利用效價測定法通過枯草芽孢桿菌β-BS01誘變和篩選實驗，探究枯草芽孢桿菌β-BS01及其誘變株對東北溫室常見真菌病害的抑制效果。采用培養基優化和紫外線誘變兩種方法對枯草芽孢桿菌β-BS01進行突變，運用隨機篩選法挑選出對東北溫室常見真菌病原菌抑制性增強的突變株并傳代10次驗證突變株的遺傳穩定。獲得了1株抑制東北溫室常見真菌病害能力增強的枯草芽孢桿菌突變株UBS-A29，其效價提高到34 AU/mL，提升了約1.7倍。經過處理后的枯草芽孢桿菌進一步加強了對真菌病害的抑制能力，具有控制和削弱溫室真菌病害的應用潛力。

枯草芽孢桿菌；抑制作用；東北溫室；紫外線誘變；效價

枯草芽孢桿菌是我國建議推廣使用的微生物生防菌[1]，因其無毒無害，可分泌多種酶類，并具有強抗逆性、優良的抑菌效果，在植物生防方面被認為是較理想的生物防治菌株[2]，常被用于促進植物生長和預防植物病害[3]。然而，從自然界中篩選純化的菌種通常抑菌效果和遺傳性狀穩定較差，單獨依賴微生物群體的自然突變來選育特異性菌株難以滿足研究和生產需要[4]，因此本實驗通過改變培養基成分及紫外誘變的方法篩選高效菌株[5]，采用誘變育種不僅可以增強芽孢桿菌對東北溫室常見真菌病害的抑制能力，而且還可以改進菌種質量，優化生產工藝，開發新品種[6]。為了進一步控制和削弱東北溫室常見的真菌病害，本試驗通過以枯草芽孢桿菌β-BS01為原始菌株，進行紫外誘變，測定突變株對指示菌效價的改變，最終獲得一株高效抑制東北溫室常見真菌病害的生防菌株，旨在為后續工廠化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株 實驗菌株為枯草芽孢桿菌β-BS01()；指示菌為番茄晚疫病(黃瓜枯萎病(sp.Owen)、辣椒炭疽病()、辣椒晚疫病()、茄褐紋擬莖點霉((Sacc. Et Syd.)Harter.)均由吉林農業大學農學院植物病理研究所惠贈。

1.1.2 培養基的配方 活化培養基配方采用BPY培養基[7]：牛肉膏4.6 g/L，酵母膏4.4 g/L，蛋白胨9.6 g/L，葡萄糖4.5 g/L，NaCl 4.5 g/L，瓊脂18.0 g/L，pH調至7.2；菌種優化培養基：牛肉膏4.5 g/L，蛋白胨9.5 g/L，NaCl 4.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MnSO4·H2O 0.4 g/L，瓊脂17.5 g/L，pH調至7.0；細菌蛋白胨液體誘變培養基(LBS)：牛肉膏2.9 g/L，NaCl 0.9 g/L，蛋白胨5.2 g/L，pH調至7.0；細菌蛋白胨培養基(LB)：牛肉膏2.9 g/L，NaCl 0.9 g/L，蛋白胨5.2 g/L，瓊脂18.5 g/L，pH調至7.0；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)：去皮馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖19.2 g/L，瓊脂19.0 g/L，pH自然。

1.1.3 主要試劑 醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、0.80%生理鹽水和吐溫-80溶液(121 ℃滅菌20min)。

1.2 方 法

1.2.1 抑菌譜的測定 以實驗室保藏的5種植物病原真菌為指示菌，采用杯碟法測定枯草芽孢桿菌β-BS01發酵上清液對真菌病原菌的抑菌效果。

1.2.2 生長曲線的測定 將4 ℃保存的枯草芽孢菌株β-BS01通過BPY培養基活化，活化后的菌株用接菌環接種于LBS培養基中，于32 ℃下160 r/min恒溫培養24~48 h，以體積分數為2%的接種量移取至250 mL液體培養基中。取樣間隔2 h，經3倍稀釋后，以蒸餾水做對照在波長600 nm下使用紫外分光光度計測OD值，橫坐標時間，縱坐標OD值作圖，即為枯草芽孢桿菌β-BS01的生長曲線。

1.2.3 枯草芽孢桿菌上清液的處理及病原體孢子懸液的制備 （1）上清液的處理：取10.0 mL培養48 h的枯草芽孢桿菌發酵液加入無菌離心管，12 000 r/min離心12 min，用無菌注射器抽取上清液，0.22 μm無菌濾膜重復過濾3次。

（2）病原菌孢子懸液的制備：病原菌接種于PDA平板上，28 ℃培養。當病原真菌孢子形成時，無菌水沖洗，無菌脫脂棉過濾，得到病原菌孢子懸液。血球計數板觀察孢子數，將其濃度稀釋到1×104cuf/mL移至無菌瓶中，封口備用。

1.2.4 上清液效價的確定及標準曲線的建立 （1）抗菌物質效價的確定。以pH為6.5的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液對發酵上清液進行倍數稀釋，即取樣200 μL進行1、1/2、1/3、1/4、1/5梯度抑菌實驗，將觀察不到抑菌圈出現的最低稀釋濃度定義為1個活力單位(1AU)，其倒數即原液的抗菌肽效價(AU/mL)。

（2）效價標準曲線的制作。將已知效價發酵液等比稀釋成9種濃度：1×10-1、2×10-1、3×10-1、4×10-1、5×10-1、6×10-1、7×10-1、8×10-1、9×10-1和1.0。分別取200 μL加入間隔的6個牛津杯于已制備好的平板A1~A10中。同時另取比例為5×10-1濃度的200 μL加入另外間隔的6個牛津杯于平板B1、B2、B3為對照試驗，每個濃度均重復3個平板。橫坐標為抑菌圈直徑的差值，縱坐標為對應的效價對數，繪制效價曲線。

1.2.5 菌株的紫外線誘變選育 （1）誘變菌懸液的制備：將活化好的菌株β-BS01以2%接種量接入牛肉膏誘變培養基中，培養至指數生長期，取10.0 mL培養液，5 500 r/min離心15 min，棄去上清液，采集菌體，用0.80%生理鹽水反復沖洗沉淀后離心，重復3次，將得到的菌懸液加入0.05 mL吐溫-80，然后充分振蕩混勻即為108個/mL細胞濃度的細胞懸液。

（2）紫外線(UV)誘變處理：開啟紫外燈預熱20 min，提取已制備的菌懸液10 mL于平板中，置于暗室36 W紫外燈下30 cm處，打開上蓋分別照射20、30、45、60、75和120 s，分別進行適當稀釋后用涂布器均勻涂布在LB培養基平板上，另做未經紫外照射的菌懸液涂布平板每個實驗重復3個平板，于32 ℃遮光條件下培養48~72 h，觀察每個平板中菌落數并記錄，所有數據均用SPSS16.30處理，做出枯草芽孢菌株β-BS01致死率曲線。

式中：為對照每平板活菌數；為處理后每平板活菌數。

（3）致死率時間選擇：選擇死亡率在80%~90%下生長出的完整菌落，經無菌水稀釋至適當濃度，涂布在平板上，30 ℃培養24 h，從培養基上隨機挑選單菌落160 r/min下發酵初篩即挑選出長勢較好抑制性較強的菌株30株轉接至斜面培養基，以出發菌株為對照，再次進行搖瓶復篩，重復3次，最終計算其效價。

1.2.6 高產菌株傳代穩定性試驗 為研究誘變的高效抑制東北溫室常見真菌病原的菌株遺傳特性是否穩定，將經紫外誘變得到的菌株按平板接種的方法，傳代10次，將每代得到的性狀優良菌株進行液體培養，測定其抑菌圈的直徑，計算效價，檢測突變菌性能穩定性。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌β-BS01抑菌譜的測定

枯草芽孢桿菌β-BS01發酵上清液對5種植物病原真菌均具有抑制作用，其中對番茄晚疫病抑制作用最好，抑制圈直徑達到了(24.92±0.60) mm(圖1)。

圖1 枯草芽孢桿菌β-BS01對部分植物病原真菌抑菌效果

圖2 枯草芽孢桿菌β-BS01的生長曲線

2.2 生長曲線的繪制

對枯草芽孢桿菌β-BS01的生長曲線進行了測定，從曲線可以看出在培養4~10 h，細胞快速生長，進入對數生長期，而14 h后菌體吸光度不變即菌體生長速率減緩。因此，要采取培養10~14 h的枯草芽孢桿菌β-BS01進行誘變實驗(圖2)。

圖3 抑菌物質標準曲線

圖4 紫外線誘變致死曲線

2.3 效價標準曲線的繪制

通過二倍系列稀釋法測定枯草芽孢桿菌β-BS01發酵上清液的效價，離心后稀釋1/4倍未出現抑菌圈，發酵上清液點樣量為200μL，說明該發酵上清液的一個活力單位為1/20其效價為20AU/mL。曲線回歸方程=0.192 9+0.885 7，回歸系數2=0.917 4。可知效價對數值與抑菌圈直徑差成良好的線性關系。因此該曲線可以作為標準曲線使用(圖3)。

2.4 紫外誘變處理

2.4.1 紫外誘變時間的選擇 出發菌株的致死率隨紫外線照射時間的增加不斷增大，照射30 s時，致死率為57.6%；照射60 s時，致死率增大至88.3%；照射120 s致死率高達97.7%。目前國內原始菌株紫外誘變致死率大多選擇80%~90%，所以本實驗選擇照射時間為60~75 s，作為最佳誘變時間(圖4)。

2.4.2 紫外誘變正突變株的篩選 利用紫外照射方法得到的枯草芽孢桿菌β-BS01突變菌株，隨機篩選30株接種于30 ℃下160 r/min搖瓶發酵復篩，按照1.2.4的方法測量發酵液效價，從中選出3株效價最高的正突變菌株(表1)。

表1 紫外線(UV)誘變篩選結果

2.5 高產菌株傳代穩定試驗

將誘變后的高效突變株枯草芽孢桿菌UBS-A03與UBS-A29在平板上連續傳代10次，每一代平面培養均進行發酵培養，其中UBS-A29的效價比較穩定(表2)。

表2 菌種傳代穩定實驗

3 討論與結論

實驗結果表明枯草芽孢桿菌β-BS01經培養基優化和紫外線誘變后得到的一株高產突變種UBS-A29具有更高的抑菌效果，其效價由出發菌株的20 AU/mL提高到34 AU/mL，約是初始菌株枯草芽孢桿菌β-BS01的1.7倍且傳代10次較為穩定，適合于工業化生產。雖然本實驗已在試驗田塊做中試，但是對于大規模田間推廣需要做進一步的研究，尤其是突變株對植物有益菌是否產生毒理作用尚未調查，對于上述問題有待于后續的研究。

[1] 楊森, 王金水, 楊小佳, 等. 枯草芽孢桿菌誘變育種研究進展[J]. 農產品加工(學刊), 2014, 13(5): 76-78.

[2] 曾地剛, 雷愛瑩, 彭敏, 等. 枯草芽孢桿菌的分離及其凈化水質的研究[J]. 水利漁業, 2007, 27(6): 55-56.

[3]Deepak V, Kalishwaralal S, Ramkumarpandian S, et al. Optimization of media composition for nattokinase production byusing response surface methodology[J]. Biore-source Technology, 2008, 99(17): 8170-8174.

[4] 王曉云, 王慧, 趙燕, 等. 紫外誘變選育高活性蛋白酶枯草芽孢桿菌及其降解飼料能力評價[J]. 中國水產科學, 2016, 23(6): 1351-1357.

[5] 高同國, 賈天瑤, 郭曉軍, 等. 枯草芽孢桿菌8-32拮抗菌株的紫外誘變選育[J]. 河北大學學報(自然科學版), 2015, 35(6): 610-615.

[6] 張哲. 改造枯草芽孢桿菌代謝通路制備透明質酸[D]. 長春: 吉林大學, 2017.

[7] 中國科學院微生物研究所. 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心菌種目[M]. 北京: 科學出版社, 1982: 12-14.

Mutation Breeding of Beta Bacillus Subtilis and Its Inhibitory Effectson Common Fungal Diseases in Northeast China

WANG Xiang-yu1, HU Mao-ying2, WU Yun-fei2, LI Lan1, REN Guo-li2*

(1. College of Science, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007, China; 2. Institute of Agricultural and Environmental Bio-technology, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154007, China)

Mutagenesis and screening experiments on Bacillus subtilis β-BS01 were conducted by using the determination of titer, and the inhibitory effects of Bacillus subtilis β-BS01 and its mutants on common fungal diseases in Greenhouses in Northeast China were explored. Mutation of Bacillus subtilis β-BS01 was carried out by two methods of medium optimization and UV mutagenesis, and, a random screening method was used to prick off the mutant strains which could inhibit the growth of common fungal pathogens in the Northeast greenhouses and verified the genetic stability of the mutant 10 generations later. A Bacillus subtilis mutant UBS-A29 which could enhance the ability of common fungal diseases in Northeast greenhouses was obtained, and its titer was increased to 34 AU/mL, which was about 1.7 times higher. The treated Bacillus subtilis further enhanced the ability to inhibit fungal diseases, and had potentials for controlling and weakening the greenhouse fungal diseases.

Bacillus subtilis; inhibition; Northeast greenhouse; UV mutagenesis; titer

Q93-335

A

2095-3704（2018）01-0016-04

2017-11-08

黑龍江省大學生創新創業訓練計劃重點項目(201710222012)和黑龍江省教育廳基本科研業務費基礎研究項目(2016-KYYWF-0546)

王相玉(1997—)，男，主要從事環境生物學研究，1251999795@qq.com；

通信作者：任國莉。

王相玉, 胡貿英, 吳云飛, 等. 枯草芽孢桿菌β-BS01誘變株對東北溫室常見真菌病害的抑制[J]. 生物災害科學, 2018, 41(1): 16-19.