澤瀉對脾虛大鼠骨骼肌線粒體結構的影響

張亞敏 林文津 徐小妹 徐榕青 劉鵬 孫鳳靈

【摘要】 目的：觀察澤瀉對脾虛大鼠骨骼肌線粒體結構的影響。方法：采用小承氣湯建立脾虛大鼠模型，采用高、中、低三個不同劑量澤瀉提取物（6.0、3.0、1.5 g/kg）對脾虛大鼠進行干預，陽性對照組灌飼四君子湯（10.5 g/kg），空白對照組灌飼等體積生理鹽水，每日1次連續(xù)灌飼2周后，迅速取骨骼肌，分別制作骨骼肌光鏡與電鏡切片，光鏡觀察骨骼肌組織、電鏡檢測骨骼肌線粒體超微結構。結果：脾虛模型組大鼠骨骼肌細胞膜破裂變性，細胞邊界模糊，肌間間隔無法分辨，線粒體外膜溶解，內嵴消失，周圍的糖原顆粒明顯減少；不同劑量澤瀉干預組大鼠骨骼肌細胞邊界有所恢復，肌間間隔也可以不同程度地分辨出來，線粒體外膜完整，內嵴較為清晰，同時周圍有明顯的糖原顆粒，不同劑量澤瀉組對骨骼肌顯微結構及線粒體結構均有改善作用，且改善程度隨澤瀉劑量的提高而增強，呈劑量依賴性。結論：澤瀉對脾虛大鼠骨骼肌組織及線粒體結構具有改善作用，為進一步研究澤瀉養(yǎng)五臟、益氣力的作用機制奠定了科學基礎。

【關鍵詞】 澤瀉； 脾虛； 骨骼肌； 線粒體； 超微結構

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Rhizoma Alismatis Extract（RAE）on skeletal muscle mitochondrial structure of rats with spleen asthenia in vivo.Method：The rat model of spleen asthenia used Xiao Chengqi Decoction.Rhizoma Alismatis high，medium and low dose groups treated with RAE（6.0，3.0，

1.5 g/kg），the positive group treated with Sijunzi Decoction（10.5 g/kg），the normal control group dealt with same volume of saline，administration once daily，after two weeks，skeletal muscle were separated，slices of two tissue were prepared，skeletal muscle and mitochondrial ultrastructure were detected by light microscopy and electron microscopy.Result：In the spleen asthenia group，skeletal muscle membranolysis，cell boundary were obscure，interval were unable to distinguish，mitochondrial outer membrane dissolved，mitochondrial crista disappeared，the number of glycogenosome decreased.In the different doses RAE treated group，skeletal muscle cell boundary recovered，interval were able to distinguish，mitochondrial outer membrane were unbroken，crista were distinct，glycogenosome increased.Compared with the spleen asthenia group，RAE would improve the spleen asthenia rats mitochondrial structure and function，appeare dose-dependent manner tendency.Conclusion：RAE could improve skeletal muscle，mitochondrial ultrastructure of rats with spleen asthenia，which provide a theoretical foundation and scientific basis for further study the effect of “nourish the five internal organs and benefit the Qili” of Rhizoma Alismatis Extract.

【Key words】 Rhizoma Alismatis Extract； Spleen Asthenia； Skeletal muscle； Mitochondrial； Ultrastructure

First-authors address：Fujian Academy of Medical Sciences，F(xiàn)ujian Key Laboratory of Medical Measurement，F(xiàn)uzhou 350001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.05.001

澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.） Juzep.的干燥塊莖，性寒，味甘、淡，歸腎、膀胱經(jīng)，具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂的功效[1]。始載于《神農本草經(jīng)》，列為上品，具有養(yǎng)五臟、益氣力、肥健之功效[2-3]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中藥澤瀉具有利尿[4]、降血脂[5-7]、降血糖[8]、抗感染[9-10]、保肝[9，11-14]、抗動脈粥樣硬化[15]、防治骨質疏松[16-17]等作用。線粒體是細胞內氧化磷酸化和形成腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）的主要場所，有細胞“動力工廠”之稱。細胞損傷的自我修復、凋亡，糖脂代謝、腫瘤的發(fā)生以及衰老等多種病理生理過程都伴隨著線粒體的能量代謝[18]。文獻[19-21]從線粒體能量代謝角度探討脾虛及健脾藥效，前文筆者報道了不同澤瀉提取物及23-乙酰澤瀉醇B對細胞線粒體能量代謝的影響[22-23]，并發(fā)現(xiàn)了澤瀉湯對高脂血癥大鼠肝臟線粒體能量代謝影響的相關蛋白[24]。本文通過觀察澤瀉對脾虛大鼠骨骼肌及其線粒體結構功能影響，為研究澤瀉養(yǎng)五臟，益氣力的作用機制提供理論基礎和科學依據(jù)。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 澤瀉藥材（批號：20150523）采集自福建省南平市建甌吉陽鎮(zhèn)，經(jīng)福建省建甌市吉陽鎮(zhèn)農技站站長葛培盛鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis（Sam.）Juzep.的干燥塊莖。甲醛、乙醇、蘇木精染液、鹽酸、伊紅、二甲苯、中性樹膠、硬脂酸、石蠟等為國產分析純。

1.2 儀器 Synergy2多功能酶標儀（BIO-TEK公司）、脫水機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司）、YB-6LF型生物組織石蠟包埋機（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司）、BA-400型熒光雙目光學顯微鏡（加拿大Motic公司）；石蠟切片機、半薄切片機、光學顯微鏡、超薄切片機（德國徠卡儀器有限公司）、透射電鏡（日本日立電鏡有限公司）。

1.3 實驗動物 SPF級SD大鼠，由上海斯萊克公司提供，雌雄各半，平均體重（200±20）g，光/暗周期為12/12 h，光照時間7：00～19：00，溫度為（23.0±0.5）℃。空氣流通，相對濕度在40%～50%間，大鼠可自由獲得飼料和飲水，適應性喂養(yǎng)一周后開始進行造模實驗。本院實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0004。

1.4 分組與給藥 SD大鼠60只，隨機分為六組（空白對照組、脾虛模型組、陽性對照組、澤瀉高劑量組、澤瀉中劑量組、澤瀉低劑量組），每組10只，雌雄各半。除空白對照組外，其余五組每日灌飼小承氣湯煎劑（大黃∶厚樸∶枳實=4∶5∶3），灌飼劑量為10 mL/kg，濃度為6 g生藥/mL，空白對照組灌飼等體積生理鹽水，隔日半量進食，自由飲水。連續(xù)灌飼4周后，陽性對照組灌飼四君子湯（灌飼劑量10.5 g/kg），澤瀉高、中、低劑量組分別灌飼澤瀉提取物（灌飼劑量6.0、3.0、1.5 g/kg），空白對照組及脾虛模型組給等體積生理鹽水。每日1次連續(xù)灌飼2周后，采用水合氯醛麻醉，迅速對大鼠骨骼肌進行取材。

1.5 肝臟組織形態(tài)學檢測 經(jīng)取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色后觀察不同組大鼠骨骼肌切片顯微結構。

1.6 肝臟組織超微結構觀察 經(jīng)取材、前固定、漂洗、后固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色后觀察骨骼肌線粒體超微結構。

2 結果

2.1 大鼠骨骼肌切片顯微結構光鏡觀察結果 空白對照組骨骼肌肌細胞無明顯腫脹，細胞膜光滑完整，肌間間隔均勻且細胞邊界清晰可見，肌間隔有少量紅細胞，細胞核的含量較多；脾虛模型組大鼠的細胞膜已經(jīng)破裂變性，大部分細胞膜已經(jīng)溶解，細胞邊界非常模糊，肌間間隔分辨不出來；澤瀉低劑量組大鼠骨骼肌部分細胞可以看到細胞邊界，細胞膜也較為完整；澤瀉中劑量組大鼠骨骼肌的邊界大部分已經(jīng)可以清晰地分辨出來，細胞膜也很完整；澤瀉高劑量組大鼠骨骼肌細胞間的邊界明顯，細胞膜完整，同時有的肌間間隔很容易分辨，但是仍然有一部分細胞的肌間間隔不易分辨；陽性給藥組的大鼠骨骼肌細胞無明顯腫脹，細胞膜光滑完整，所有細胞肌間間隔均勻且細胞邊界清晰可見，細胞核的含量較多。各組大鼠骨骼肌切片顯微結構，見圖1。

2.2 大鼠骨骼肌線粒體電鏡觀察結果 空白對照組骨骼肌在40 000倍透射電鏡下可以清晰地看到平行肌絲構成的肌原纖維，肌絲的粗細非常清晰，并有明暗相間的橫紋，同時還可以看到，在明帶中央由電子密度較深的Z線，在暗帶中部有較明的H帶。肌原纖維之間橢圓形封閉的囊狀結構為線粒體，線粒體外膜結構完整，有內外兩層，內層結構折疊形成嵴，線粒體排列較為整齊，同時還可以看到線粒體周邊存在大量的糖原顆粒。脾虛模型組骨骼肌在透射電鏡下雖然也可以看到平行肌絲構成的肌原纖維，且粗絲、細絲結構較為清晰，但是大多數(shù)的線粒體結構已經(jīng)發(fā)生明顯變化，有的線粒體外膜已經(jīng)溶解，有的線粒體內部的嵴已經(jīng)消失形成空泡，甚至發(fā)生腫脹，線粒體周圍的糖原顆粒也明顯減少；澤瀉低劑量組內一部分線粒體結構明顯發(fā)生變化，內嵴消失空泡，甚至發(fā)生腫脹，但是依舊可以看到一部分細胞膜比較完整，能呈現(xiàn)出較為完整的線粒體結構；澤瀉中劑量組可以明顯看到一些完整的線粒體結構，外膜完整，未發(fā)生溶解，但是線粒體大小懸殊，一些線粒體外膜發(fā)生溶解，且糖原顆粒較少；高劑量組可見一些非常完整的線粒體，線粒體外膜結構完整，內層結構折疊形成嵴也較為清晰，同時周圍有明顯的糖原顆粒；陽性給藥組線粒體外膜結構完整，嵴清晰，周圍有較多明顯的糖原顆粒。各組大鼠骨骼肌切片電鏡照片，見圖2。

3 討論

目前脾虛動物模型的研究較為全面，主要包括苦寒瀉下法、破氣耗氣法、飲食傷脾法、偏食五味法、勞倦傷脾法、理化因素損傷法、復合因素造模法等[25]。本研究采用的破氣耗氣法是依據(jù)脾虛忌下，長期或過用廣豆根、檳榔、厚樸、枳實、厚樸等破氣降氣中藥，逆脾氣主升之性從而造成脾氣虛證。破氣耗氣法是由苦寒瀉下法演變而成，主要是為了延長造模時間，避免傷陰、傷陽和導致中氣下陷。本實驗發(fā)現(xiàn)，建立的脾虛模型大鼠體重增速明顯降低，活動程度明顯下降，毛色差，糞便稀，符合中醫(yī)脾氣虛證相關指標。

骨骼肌作為大鼠的主要運動組織，需要消耗大量的能量進行伸縮活動，內含較多的線粒體，當外部環(huán)境發(fā)生變化導致線粒體能量代謝發(fā)生障礙的時候，會影響骨骼肌線粒體的功能，在線粒體的結構上亦可表現(xiàn)出來。光鏡與透射電鏡觀察結果表明，澤瀉各給藥組能改善脾虛大鼠骨骼肌及其線粒體超微結構，而且澤瀉的作用隨著給藥劑量的增加而加強，呈現(xiàn)出劑量依賴性，另外實驗過程中筆者還初步檢測了線粒體膜電位、ATP含量、琥珀酸脫氫酶（SDH）、活性氧簇（ROS）活性等指標，初步結果也支持這一結論，與文獻[22-23]報道的研究結果一致。

試驗設計過程中，筆者還選擇了胃黏膜組織進行線粒體結構和功能的檢測，但試驗結果發(fā)現(xiàn)，胃黏膜上線粒體較少，線粒體功能指標組內差異較大，有可能是胃黏膜取樣時，取樣難度較大，花費的時間較長，此時線粒體已損傷，再檢測膜電位等指標時，已不能反映體內的實際情況，誤差較大，不適合作為脾虛治療效果好壞的評價標準，骨骼肌相對來說線粒體含量較高，所以受實驗操作的影響較小，可以部分線粒體活性指標反映出線粒體能量代謝的情況。

清代醫(yī)學家陳修園在《神農本草經(jīng)讀》中提到：“五臟主藏陰，而脾為五臟之原，一得水精之氣則能灌溉四旁，俾五臟循環(huán)而受益，不特肥健消水不饑，見本藏之功”。因此，筆者推測陳修園所謂澤瀉的“養(yǎng)五臟、益氣力”功效，其機制可能與澤瀉能夠改善骨骼肌線粒體能量代謝有關，其具體分子機制還有待于下一步研究。

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