兔病毒性出血癥蜂膠滅活疫苗的研制

呂遠蓉 王懷禹 魏 玲 南充職業技術學院 637000

兔病毒性出血癥 （Rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一種急性、烈性傳染病，該病傳播快、病死率高，可給兔場造成災難性打擊，是目前危害養兔業的主要疫病之一[1]。蜂膠是由蜜蜂采集的植物樹脂與其自身的消化腺等的分泌物混合而形成的一種膠黏性固體物，具有殺菌、抗病毒、抗腫瘤、促進組織再生、抑制過氧化物生成等廣泛的藥理活性及保健功能，將其作為疫苗佐劑既能增強體液免疫能力，又可促進細胞免疫能力，可有效提高疫苗的免疫效果[2]。本研究將蜂膠作為疫苗佐劑，制備了RHDV滅活疫苗，并分析了其免疫效果，以期為RHD新型疫苗的研制開發和推廣應用奠定基礎。

1 材料和方法

（1）毒株、試驗動物、蜂膠。兔病毒性出血癥病毒（組織毒）由南充職業技術學院種畜場實驗室分離并保存；2月齡健康新西蘭白兔購自黎明種兔場；蜂膠購自山東綠都安特動物藥業有限公司。

（2）活抗原的制備與檢驗。將RHDV與10倍體積滅菌生理鹽水搗碎后，頸部皮下注射易感兔，1mL/只，無菌采集接種后24～96小時內死亡兔的肝臟，將其與5倍體積滅菌生理鹽水充分搗碎，-70℃下保存。將制備的RHDV抗原用滅菌生理鹽水依次進行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 和 10-6 10 倍倍比稀釋， 取各稀釋度頸部皮下注射易感兔5只，根據Reed-Muench法計算抗原對家兔的半數致死量（LD50）。

（3）滅活抗原的制備與檢驗。取制備的RHDV抗原2000mL，加入甲醛溶液8mL，即甲醛終濃度為0.4%，密封后，37℃下作用48小時，4℃下保存。效價測定。測定滅活抗原對人“O”型紅細胞的凝集效價。無菌檢驗。按《中華人民共和國獸藥典》三部二○一五年版附錄3306進行，應無菌生長。滅活檢驗。取滅活抗原皮下注射易感兔5只，4mL/只，觀察10天，應全部健活。

（4）蜂膠滅活疫苗的制備與檢驗。將蜂膠碾碎后與10倍體積無水乙醇混合，攪拌溶解后靜置，上層澄清透明的栗色溶液即為蜂膠乙醇提取液。將RHDV滅活抗原與蜂膠乙醇提取液等體積混合，高速乳化，無菌分裝，20mL/瓶，4℃下保存。物理性狀檢驗，應為黃褐色均勻混懸液，靜置后底部有少量沉淀。無菌檢驗，按《中華人民共和國獸藥典》三部二0一五年版附錄3306進行，應無菌生長。安全檢驗，取滅活疫苗皮下注射易感兔4只，4mL/只，觀察10天，應全部健活。

（5）疫苗最適免疫劑量的確定。給20只易感兔分別注射疫苗0mL、0.25mL、0.5mL和1.0mL，免疫后14天，各組兔皮下注射1000 LD50的RHDV活抗原，觀察7天。

（6）疫苗免疫保護期的確定。取滅活疫苗皮下注射易感兔 40 只，0.5mL/只， 分別在免疫后 3、5、7、14、30、60、120和 180天隨機取 5只兔皮下注射 1000 LD50的RHDV活抗原，根據攻毒兔的死亡情況判斷疫苗的免疫保護期。

（7）疫苗保存期的確定。將疫苗在4℃下分別保存3、6、9、12和18個月后， 分別注射易感兔 5只，0.5mL/只免疫后14天，各組兔皮下注射1000 LD50的RHDV活抗原，根據攻毒兔的死亡情況判斷疫苗的保存期。

2 結果與分析

（1）活抗原的檢驗。根據Reed-Muench法測定活抗原對家兔的LD50為10-5.17/mL。

（2）滅活抗原的檢驗。滅活抗原對人“O”型紅細胞的凝集效價為1∶1024，無菌檢驗合格，滅活檢驗合格。

（3）滅活疫苗的檢驗。物理性狀檢驗合格，無菌檢驗合格，安全檢驗合格。

（4）最適免疫劑量的確定。如表1所示，疫苗免疫0.25mL可提供80%的保護率，免疫0.5mL可提供100%的保護率，確定疫苗的最適免疫劑量為0.5mL。

（5）疫苗免疫保護期的確定。疫苗免疫后3天可提供40%的保護率，免疫后5天可提供80%的保護率，免疫后7天可提供100%的保護率，至疫苗免疫后180天仍可提供100%的保護率。

（6）疫苗保存期的確定。如表3所示，疫苗在4℃下保存18個月后，保護率仍為100%。

3 討論

隨著我國綠色、環保、健康養殖理念的普及，安全環保、抗體產生快、免疫保護期長等指標逐步成為新型動物疫苗的研究方向。本研究以自行分離的RHDV毒株為疫苗毒種，以蜂膠作為疫苗佐劑，成功制成RHD蜂膠滅活疫苗。試驗結果表明，該疫苗對家兔的刺激小，無不良反應，具有良好的安全性。疫苗以0.5mL/只的劑量免疫后7天即可提供100%的保護率，且至疫苗免疫后180天仍可提供100%的保護率，具有抗體產生快，持續期長等優點。分析該疫苗抗體起效快、免疫期持久的原因，可能為蜂膠顆粒與裸露游離的病毒粒子相互交聯形成類免疫刺激復合物的特殊結構，接種于機體后該特殊結構可迅速刺激機體產生免疫應答反應，并具有抗原“倉庫”作用，刺激機體一直產生高水平的免疫抗體。總之，以蜂膠作為佐劑的RHDV滅活疫苗抗體產生快、免疫保護期長、疫苗保存期長，是一種值得推廣的新型RHD疫苗。

參考文獻:

[1]李岳余，張立穎.兔病毒性出血癥的防治[J].中國動物保健，2016，18（3）：27-28.

[2]王凱，何天駿，胡福良.蜂膠佐劑在獸用疫苗中的應用[J].動物醫學進展，2013，34（10）：111-115.