超高效液相色譜-串聯質譜測定畜禽肉中硝基呋喃代謝物方法關于pH值的優化探討

焦作市畜產品質量安全監測中心 454150

1 引言

硝基呋喃類抗生素是具有5-硝基呋喃基本結構的廣譜抗菌藥物，主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因，能夠有效防治傷寒、副傷寒和家禽原蟲病（如球蟲、組織滴蟲、卡氏白細胞原蟲等），還對大腸桿菌性敗血癥及呼吸道疾病的繼發性細菌感染有一定的防治效果[1]。硝基呋喃類作為獸藥主要用于抗菌消炎，廣泛應用于家畜家禽的痢疾、腸炎、球蟲病的預防和治療[2]，也在動物飼料中作為添加劑使用[3]。硝基呋喃類藥物在動物體內代謝迅速，但其代謝物與動物組織蛋白結合穩定存在，具有致畸、致突變和致癌作用。

研究表明，禽肉中硝基呋喃類代謝物含量比其他動物組織中高，因此準確快速檢測硝基呋喃類代謝物可以增加畜禽產品的質量安全。超高效液相色譜-串聯質譜法檢測硝基呋喃類代謝物具有快速、準確和靈敏度高的特點，其中前處理中pH值的調節較大影響實驗的準確度，本文重點探討pH值的優化條件。

2 材料

（1）儀器與試劑。液相色譜-串聯質譜儀（配電噴霧離子源）美國Waters公司Waters ACQUTYTM UPLCXevo TQ-S、天平感量0.01g、渦旋混合器、振蕩器、組織勻漿機、離心機、恒溫振蕩水浴搖床、氮吹儀和pH計。AOZ對照品、內標AOZ-D4對照品、AMOZ對照品、內標AMOZ-D5對照品、AHD對照品、內標AHD-13C3對照品、SEM·HCI對照品、內標 SEM·HCI-[1,2-15N2;13C]對照品、2-硝基苯甲醛、乙酸銨、磷酸三鉀、濃鹽酸、乙酸乙酯、甲醇色譜純、甲酸色譜純、乙腈色譜純。

3 方法步驟

（1）試樣的制備。取適量新鮮或冷凍的空白或供試樣品，混勻。

（2）質量控制樣品的制備。取空白試樣，與待測樣品同步處理。取空白試樣2g，添加20ng/mL的混合標準中間工作液0.1mL與20ng/mL的混合內標中間工作液0.1mL，制得濃度1.0μg/kg的陽性添加試料，與待測試樣同步處理。

（3）洗滌。稱取供試試料2±0.02g置具塞離心管中，加10mL50%甲醇溶液，渦旋，中速振蕩10分鐘，然后8000r/分鐘離心5分鐘，棄上清液（小心緩慢地將上清液倒掉即可）。向離心管中加入10mL50%甲醇溶液，重復洗滌一次。按上述洗滌過程用乙醚洗滌2次。

（4）衍生。洗滌后試料加20ng/mL的混合內標準中間液0.1mL、用刻度吸管加入0.2mo1/L鹽酸5mL和0.1mo1/L2-硝基苯甲醛的溶液100uL，渦旋、混勻。（37±1）℃避光水浴震蕩約16小時。

（5）提取。將衍生后的試料在避光條件下自然冷卻至室溫，用1mo1/L磷酸三鉀溶液調節pH值至6、7、7.3、7.6、8、9（衍生加入 0.2mo1/L 鹽酸溶液 5mL 的試料需加入1mo1/L磷酸三鉀溶液約0.85mL）。加乙酸乙酯5mL，渦旋、中速振蕩5分鐘，3000r/分鐘離心10分鐘，吸取上清液；用乙酸乙酯5mL重復提取一次，合井乙酸乙酯層于40℃水浴下氮氣吹干。用初始流動相（5%乙腈含0.1%甲酸）水溶液1.0mL溶解殘余物（若發現試樣渾濁，可將試樣轉移到1.5mL離心管，2000r/分鐘離心10分鐘），經過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

4 結論

本試驗優化了超高效液相串聯質譜法測定雞肉中硝基呋喃類藥物代謝物的方法。樣品經洗滌后去除雜質，在酸性條件下水解，與加入的2-硝基苯甲醛溶液進行衍生化反應，反應產物調pH7.6后經乙酸乙酯提取，氮氣吹干，5%乙腈含0.1%甲酸水溶液溶解殘余物，用高效液相色譜-串聯質譜儀測定。四種硝基呋喃代謝物內標的使用補償了前處理過程對最后定量結果的影響，結果準確可靠。