PCR探針熔解曲線法在對肺結核患者進行結核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應用效果

常鳳霞

（青海省第四人民醫院檢驗科，青海 西寧 810000）

耐多藥結核病是一種對利福平及異煙肼同時具有耐藥性的結核病。此病屬于結核病治療中的重點及難點[1]。對耐多藥結核病患者的病情及時進行診斷，并動態地監測其結核分枝桿菌的耐藥性，是為其制定有效的抗結核化療方案的關鍵[2]。目前，臨床上對耐多藥結核病患者結核分枝桿菌的耐藥性進行監測的主要方法是進行結核分枝桿菌藥敏試驗。但是，進行結核分枝桿菌藥敏試驗較為費時，且存在標準化困難等缺點[2]。結核分枝桿菌耐藥基因檢測具有用時短、可有效縮短臨床用藥指導的時間等優勢[3]。本次研究主要探討PCR探針熔解曲線法在對肺結核患者進行結核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象為2018年1月至2018年3月期間在青海省第四人民醫院門診或住院部接受治療20例肺結核患者。

1.2 研究方法

使用PCR探針熔解曲線法對這20例患者體內結核分枝桿菌對利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥性進行耐藥基因檢測，方法是：1）采集患者3～5 mL的痰液作為檢測標本。2）對檢測標本進行痰結核分枝桿菌培養、鑒別及藥敏試驗，然后從中分離出20株結核分枝桿菌。另取30株野生型結核分枝桿菌（H37Rv標準菌株，由國家結核病研究所提供）。3）對這50株結核分枝桿菌對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥性進行耐藥基因檢測，方法是：⑴本次研究使用的試劑與儀器有PCR試劑[由生工生物工程（上海）有限公司生產]，結核分枝桿菌對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥突變檢測試劑盒（由廈門致善生物科技有限公司生產），PCR儀（由德國羅氏公司生產）。⑵對這50株待檢結核分枝桿菌的菌株進行復活、接種及滅活，然后采用煮沸法提取菌株中的基因組DNA，并對其進行加樣。⑶分別設立陰性DNA5 td和陽性對照品DNA5 td。對這50株菌株進行擴增后，使用PCR探針熔解曲線法檢測其對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的基因突變情況。獲取這50株菌株對上述四種抗結核藥物的耐藥情況。其中，使用利福平進行檢測時菌株復合群rpoB基因在27個氨基酸密碼子區域內存在的突變的情況；使用異煙肼進行檢測時菌株ahpC啟動子區、inhA94密碼子區及inhA啟動子區、katG315密碼子區內存在突變的情況；使用乙胺丁醇進行檢測時菌株在embB306、embB497、embB368、embB378、embB 380及embB406位密碼子存在突變的情況；使用鏈霉素進行檢測時菌株在rpsL基因43位密碼子、基因88位密碼子、TTS基因513～517位點及TTS基因905～908位點存在突變的情況。

1.3 觀察指標

以藥敏試驗的結果為金標準，觀察這20例患者體內結核分枝桿菌的耐藥基因檢測結果與利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥表型的一致性。

2 結果

這20例患者體內結核分枝桿菌進行耐藥基因檢測的結果與利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥表型的一致性分別為：利福平為98%（49/50）、異煙肼為96%（48/50）、乙胺丁醇為62%（31/50）、鏈霉素為76%（38/50）。這些患者的結核分枝桿菌的耐藥基因檢測結果與利福平、異煙肼耐藥表型的一致性較高，其結核分枝桿菌的耐藥基因檢測結果與乙胺丁醇、鏈霉素耐藥表型的一致性較低。

3 討論

相關的研究發現，引起結核分枝桿菌發生耐藥的分子機制與其存在基因突變有關。結核分枝桿菌發生不同的基因突變，會導致其對不同藥物產生耐受性[2，4]。對耐多藥肺結核患者體內結核分枝桿菌進行耐藥基因檢測具有以下優點：1）可快速地了解患者體內的結核分枝桿菌耐藥基因的位點是否發生突變，有利于對患者的用藥種類進行篩選。2）可在對患者進行動態的藥學監測，及時了解其結核分枝桿菌菌株的耐藥信息、耐藥基因突變位點的變化，有利于準確地找到其體內結核分枝桿菌菌株產生耐藥的原因，便于有針對性地為其調整治療方案。3）可有效地阻斷患者耐藥結核分枝桿菌的傳播途徑，有助于控制其病情的進展[5]。有研究表明，PCR技術可以把擴增與檢測合二為一，可實時進行擴增及檢測，能夠在同一時間檢測結核分枝桿菌耐藥的多個相關基因突變情況，具有高效、便捷等優點，尤其適用于臨床上對大批量基因突變的結核分枝桿菌進行篩查[3，5]。本次研究的結果顯示，這些患者體內結核分枝桿菌的耐藥基因檢測結果與利福平、異煙肼耐藥表型的一致性較高，其體內結核分枝桿菌的耐藥基因檢測結果與乙胺丁醇、鏈霉素耐藥表型的一致性較低。此研究結果與胡春梅等[5]的研究結果相符。

綜上所述，PCR探針熔解曲線法在對肺結核患者進行結核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應用效果顯著，可迅速地篩查出患者體內結核分枝桿菌對利福平等常用一線抗結核藥的耐藥情況。