超聲輔助萃取-液相色譜-串聯質譜法同時檢測水產品中11種有機磷酸酯類阻燃劑

索莉莉,朱群英,胡美華

(南昌市疾病預防控制中心,江蘇南昌 330038)

近年來,隨著鹵系阻燃劑對環境危害的加劇,其應用逐漸減少,因此,危害相對較小的磷系阻燃劑得到了廣泛地應用[1]。作為一類重要的磷系阻燃劑,有機磷酸酯(organophosphate esters,OPEs)廣泛應用于紡織、家用產品、建材、化工以及電子等領域。OPEs 主要以添加而非化學鍵合方式[2]進入材料中,且大多數具有半揮發性,因此很容易通過揮發、滲漏和磨損等方式進入周圍環境中[3]。由于使用量大,OPEs引起的環境問題已不容忽視,目前已經普遍存在于水體[45]、土壤[6]和生物體[78]中。而水體中的OPEs會使各種水生生物體內的OPEs含量增多,這不僅會對魚類及其他水生生物造成危害,更會通過食物鏈進一步對人體造成危害[3]。有研究表明,OPEs具有致癌性、神經毒性和生殖毒性[9]。當前,OPEs的分析檢測主要集中在玩具、紡織品、木制品、土壤、水等基質較簡單的樣品,而魚類等復雜水產品中OPEs的檢測報道卻非常少。因此,建立一種簡單、快速的檢測方法,并將其應用于魚類及水產品等復雜基質中OPEs的分析檢測顯得尤為重要。

近年來,對于固體樣品中 OPEs 的提取,主要方法有超聲輔助萃取(ultrasoundassisted extraction,USAE)[1011]、微波輔助提取(microwaveassisted extraction,MAE)[7,1213]、加速溶劑萃取(ASE)[8,14]、索氏提取(Soxlet extraction,SE)[15]等。USAE方法簡單、省時、有機溶劑消耗量較少。MAE具有時間短、溶劑用量少等優點,但是MAE的提取效率受溶劑的選擇影響很大[16],限制了其應用及發展。ASE 自動化程度高、萃取效率高,與USAE相比,需要購買較昂貴的儀器設備。SE方法成熟、穩定,但有機溶劑消耗量大、時間長。

OPEs的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[1719]、氣相色譜質譜法(GCMS)[47,11,14]、液相色譜質譜法(LCMS)[2022]等。GC和GCMS對 OPEs 具有很好的靈敏度和選擇性,但是由于其普遍存在色譜峰拖尾的現象[23],制約了GC和GCMS的應用。與 GCMS 相比,LCMS 更適用于極性較強的以及分子量較大、不易揮發的 OPEs(例如 TEHP)的分析檢測。

本文建立了超聲輔助萃取液相色譜串聯質譜法同時檢測水產品中11種OPEs,本方法前處理簡單、快速、基質干擾較少,萃取效率高,完全能滿足對水產品中OPEs分析檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

淡水魚、帶魚、蝦、青蛙、泥鰍和黃鱔 隨機購于南昌各超市和農貿市場,去皮取肌肉部分,剁碎,在18 ℃下避光保存;磷酸三(2氯異丙酯)(Tris(2chloroisopropyl)phosphate,TCPP,純度為99.0%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司,批號31118;磷酸三丙酯(Trisnpropylphosphate,TnPP,純度為99.6%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司,批號105408;磷酸三(2乙基己基)酯(Tris(2ethylhexyl)phosphate,TEHP,純度為98.0%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司,批號21120;磷酸三間甲苯酯(Trimcresyl Phosphate,TMCP,純度為97.5%) 美國 Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批號AP16070510;三苯基氧膦(Triphenlphosphine oxide,TPPO,純度為98.97%) 美國Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批號AL15051804;磷酸三鄰甲苯酯(Triotolyl phosphate,TOTP,純度為98.2%) 美國Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批號BL16041408;磷酸三甲苯酯(Tricresyl Phosphate,TCrP,純度為99.8%) 美國Stanford Analytical Chemicals Inc. 公司,批號AP15042406;磷酸二苯辛酯(2Ethylhexyl diphenyl phosphate,EHDPP,純度為98.09%) 美國Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批號MS16040319;磷酸三苯酯(Triphenyl Phosphate,TPhP,純度為99.82%) 美國Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批號BL16052607;磷酸三丁酯內標物(Trinbutyld27 Phosphate,TnBPd27,純度為99.4%) 美國Stanford Analytical Chemicals Inc.公司,批號BC232;磷酸三異丁酯(Phosphoric Acid Tris(2methylpropyl)Ester,TiBP,純度為98.0%) 上海ANPEL公司,批號61690004;磷酸三丁酯(Tributyl Phosphate,TnBP,純度為99.57%) 加拿大CDN ISPTOPES公司,批號AL15120416;甲醇 LCMS級,美國Honeywell公司;二氯甲烷、正己烷、乙腈 均為色譜純,美國Honeywell公司;四氫呋喃、丙酮 均為色譜純,美國天地有限公司;甲酸 LCMS級,美國ANAQUA公司;超純水 實驗室自制。

LC30A型高效液相色譜儀(包括:高壓泵、柱溫箱、脫氣機、自動進樣器) 日本島津公司;QTRAP?4500型串聯質譜儀 美國AB SCIEX公司;氮吹儀 美國Organomation公司;216HL型低溫離心機 SIGMA公司;KQ500DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;MilliQ超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的前處理 準確稱取“1.1”所述方法處理后的樣品0.5 g,加入50 μL內標物TnBPd27(1.0 μg·mL-1),混合均勻后,加入一定量的萃取溶劑,超聲萃取一定時間后,12000 r·min-1離心10 min,將上清液氮吹至近干,加入甲醇溶解、定容至1 mL,12000 r·min-1離心10 min,0.22 μm有機相濾膜過濾,待測。

1.2.2 液相色譜條件 柱溫:40 ℃;進樣體積:10 μL;色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×100 mm,1.7 μm)不銹鋼柱;流動相A為0.1%甲酸甲醇,流動相B為0.1%甲酸水,梯度洗脫程序:0.01 min,60% B;2.5 min,60% B;3 min,35% B;4.5 min,35% B;5 min,15% B;7 min,9% B;8 min,5% B;11 min,5% B;11.5 min,60% B;15 min,60% B;流速:0.4 mL·min-1。

1.2.3 質譜條件 電噴霧離子源ESI;正離子MRM掃描;離子源溫度:500 ℃;離子源電壓:5500 V;氣簾氣:35 psi;碰撞氣:中等;霧化氣(GS1):50 psi;輔助氣(GS2):50 psi;質譜分析參數見表1。

表1 有機磷酸酯類阻燃劑的質譜分析參數Table 1 MS parameters for organophosphate esters

1.2.4 標準溶液的配制 標準儲備溶液:準確稱取標準品0.0100 g,用甲醇溶解并定容到10 mL棕色容量瓶中,配制成1000 μg·mL-1的標準儲備溶液,在18 ℃下避光保存。

內標儲備溶液:準確稱取TnBPd27標準品0.0100 g,用甲醇溶解并定容到10 mL棕色容量瓶中,配制成1000 μg·mL-1的標準儲備溶液,在18 ℃下避光保存。

標準工作溶液:分別取上述標準儲備液適量,用甲醇定容至10 mL,配制成已知濃度的中間標準工作溶液。用甲醇稀釋成系列濃度的混合標準工作溶液,密封,4 ℃下保存,備用。

內標使用溶液:準確吸取上述內標儲備溶液100.0 μL,用甲醇定容至100 mL,配制成濃度為1.0 μg·mL-1的內標使用溶液,密封,4 ℃下保存,備用。

2 結果與分析

2.1 萃取條件的優化

2.1.1 萃取溶劑的選擇 各有機磷酸酯類阻燃劑的結構和性質不盡相同,因而不同極性有機溶劑的萃取效率也不同。考察了甲醇、丙酮、乙腈、正己烷、四氫呋喃和二氯甲烷6種不同極性的有機溶劑對水產品中11種有機磷酸酯類阻燃劑的萃取效果。在超聲時間為10 min和萃取體積為10 mL的條件下,按 “1.2.1”所述進行樣品處理,結果見圖1。從圖1可知,二氯甲烷對這11種有機磷酸酯類阻燃劑的萃取效率優于甲醇等其他5種萃取溶劑。二氯甲烷對11種有機磷酸酯類阻燃劑的萃取效率均能達到90% 以上。因此,本實驗選擇二氯甲烷作為最佳萃取溶劑。

圖1 萃取溶劑種類對有機磷酸酯類阻燃劑萃取效率的影響Fig.1 Extraction efficiencies of OPEs by different extraction solvents

2.1.2 萃取體積的優化 萃取體積的量影響著萃取效率的好壞。在超聲時間為10 min的條件下,本文考察了二氯甲烷體積(5～20 mL)對萃取效率的影響。隨著萃取體積由5 mL增大到10 mL時,各有機磷酸酯類阻燃劑的萃取效率逐步提高,達到95%以上,當萃取體積增大到20 mL時,各目標物的萃取效率基本保持不變,見圖2。因此,選擇10 mL為最佳的萃取體積。

圖2 萃取溶劑體積對有機磷酸酯類阻燃劑萃取效率的影響Fig.2 Extraction efficiencies of OPEs by different solvent volumes

2.1.3 萃取時間的優化 超聲時間的長短也影響目標物萃取效率的高低。為此,本研究考察了不同超聲萃取時間(2～20 min)對萃取效率的影響,見圖3。由圖3可見,隨著超聲萃取時間由2 min增加到10 min時,11種目標分析物的萃取效率逐步提高。當超聲時間高于10 min,各目標物萃取效率基本趨于穩定。因此,選擇10 min作為最佳的超聲萃取時間。

圖3 萃取時間對有機磷酸酯類阻燃劑萃取效率的影響Fig.3 Extraction efficiencies of OPEs by different extraction times

2.2 流動相的選擇

本實驗考察了兩種有機溶劑(甲醇和乙腈)水作為流動相對11種有機磷酸酯類阻燃劑分離度和響應的影響。實驗結果表明,兩種有機溶劑均能達到良好的分離效果,而甲醇作為有機相時,各分析物的響應較乙腈高,因此,選用甲醇水作為本實驗的流動相。同時,還考察了甲醇水、甲醇(0.1%甲酸)水(0.1%甲酸)和甲醇(0.2%甲酸)水(0.2%甲酸)為流動相對響應和峰形的影響。結果發現,隨著流動相中甲酸含量的增加,TnPP、TPPO、TCPP和TEHP的響應無明顯變化,其他分析物的響應則有所降低。另外,實驗結果還發現,隨著流動相中甲酸含量增加為0.1%,各分析物的色譜峰變得更尖銳,而當流動相中甲酸的含量增加至0.2% 時,各分析物的色譜峰形有所展寬。綜合考慮以上因素,選擇甲醇(0.1%甲酸)水(0.1%甲酸)作為本實驗的流動相。

表 2 有機磷酸酯類阻燃劑的線性方程、相關系數、檢出限、定量限及日內和日間精密度Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r),limits of detection(LOD),limits of quantitation(LOQ),intraday and interday precision of OPEs

2.3 方法驗證

按照“1.2.4”所述方法配制一系列不同濃度的混合標準溶液,在“1.2.2”所述的色譜條件和“1.2.3”所述的質譜條件下對各混合標準溶液進行測定,其標準圖譜見圖4,結果見表2。由表2可知,11種有機磷酸酯類阻燃劑在一定濃度范圍內與其對應的峰面積比(標準與內標物的峰面積比值)呈良好的線性關系(r=0.9986～0.9997),11種組分的方法定量限(LOQ,S/N=10)為 0.020～5.71 μg·kg-1,檢出限(LOD,S/N=3)為 0.0060～1.71 μg·kg-1。在同一日內,對低、中、高三種濃度水平的混合標準溶液連續檢測五次,得到日內精密度。并連續五日對低、中、高三種濃度水平的混合標準溶液進行檢測,得到日間精密度,如表2所示。結果表明,各分析物的日內精密度為0.30%～3.0%,日間精密度為0.44%～3.7%,說明該方法的重現性良好。

圖4 OPEs液相色譜串聯質譜圖Fig.4 LCESI+MS/MS chromatogram of the OPEs standards

同時,為驗證該方法的可行性,研究了淡水魚、帶魚、河蝦、青蛙、泥鰍和黃鱔等不同種類樣品低、中、高3個水平加標回收率實驗,每個水平測定3個平行樣。表3為各目標物的回收率及相對標準偏差。由表3可見,各樣品的平均加標回收率在91.2%～110.5%之間,相對標準偏差均在 0.14%～6.6%之間,說明該方法適用于淡水魚等6類水產品的檢測。

表3 水產品中各分析物的加標回收率(%)Table 3 Recoveries of OPEs in aquatic products(%)

2.4 實際樣品的測定

將隨機購于南昌各超市和農貿市場的水產品樣品,取肌肉部分,采用本方法對6種不同類型的水產品進行測定,結果見表4。由表4可見,這6種類型的樣品中均未檢出TnPP、TEHP、TOTP、TCrP、TMCP、EHDPP、TPhP和TPPO,而TiBP、TnBP和TCPP均有檢出,其中TiBP的含量為1.04～1.81 μg·kg-1,TnBP的含量為0.92～1.93 μg·kg-1,TCPP的含量為23.7～30.9 μg·kg-1。圖5為實際樣品加標后的色譜圖,由圖5可見,目標化合物周圍干擾較少。

圖5 魚肉樣品加標后的液相色譜串聯質譜圖Fig.5 LCESI+MS/MS chromatogram of real fish sample spiked with OPEs

表4 水產品中各分析物的含量Table 4 Contents of OPEs in aquatic products(μg·kg-1)

這6種類型的樣品中均檢出了TiBP、TnBP和TCPP,經查閱了國內外文獻,發現這3種分析物中,TCPP的研究最多,檢出率也最高,其次是TnBP,檢出率相當高,而TiBP的研究相對較少,但仍有陽性樣品檢出。望秀麗等[14]采用加速溶劑萃取氣相色譜質譜法,檢測出塑料中TCPP的含量為11.2 mg/kg;董麗君等[20]采用液相色譜串聯質譜法測出木制品中TCPP的含量為0.47～6.35 mg/kg;鹿建霞等[11]采用氣相色譜/質譜法檢測出土壤中TCPP的含量為15.5～16.7 ng/g;秦宏兵等[5]采用固相色譜氣相色譜/質譜法測得不同國家的水體中TCPP的含量為22.6～663 ng/L。鹿建霞等[11]采用氣相色譜/質譜法檢測出土壤中TnBP的含量為0.6～0.8 ng/g;秦宏兵等[5]采用固相色譜氣相色譜/質譜法測得不同國家的水體中TnBP的含量為15～1510 ng/L;Kim[24]采用超高效液相色譜串聯質譜法檢測出不同種類的魚中TnBP的含量為2.9～420 ng/g。梁鈧等[22]采用超高效液相色譜串聯質譜法測出污水中TiBP的含量為35.2 ng/L。另外,從這3種化合物的檢出值可以看出,其含量比較接近,這是由于本課題所使用的水產品均采購于南昌市的商場和農貿市場,它們極有可能來源于同一水體也就是同一污染源中[11]。

3 結論

目前,對OPEs的分析檢測主要集中在玩具、紡織品、木制品、土壤、水等基體較簡單的樣品,而對于復雜的生物樣品如魚肉等水產品樣品中OPEs的檢測報道較少。本文采用超聲輔助萃取技術,以二氯甲烷為萃取溶劑提取水產品中的有機磷酸酯類阻燃劑,并應用高效液相色譜串聯質譜法對水產品中的11種有機磷酸酯類阻燃劑進行測定。該方法前處理簡單快速、基質干擾少、萃取效率高。應用此方法能夠實現水產品中多種OPEs的同時測定。

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