母乳揮發(fā)性成分固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用檢測條件的優(yōu)化及測定

高雅慧,李子杰

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

母乳是嬰兒最天然、最安全、最理想的食物來源,被稱為人類的“白色血液”。對嬰兒來說,腸道菌群尚未完全形成,其腸道、呼吸道容易受到感染,母乳對于維持嬰兒的健康具有至關(guān)重要的作用[1]。同嬰幼兒配方奶粉相比,母乳喂養(yǎng)嬰兒的病死率顯著降低[24]。母乳喂養(yǎng)除了能促進嬰兒生長和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育外,對肥胖、高血壓、高血脂、II型糖尿病等疾病均有一定的預(yù)防作用[56]。此外,母乳中所特有的活性物質(zhì)及微生物,對于增強嬰兒免疫力和腸道菌群的建立起著重要作用[712]。

母乳喂養(yǎng)具有人工喂養(yǎng)無法比擬的優(yōu)點,但相當一部分母親由于工作或身體的原因而不能持續(xù)進行母乳喂養(yǎng),只能選取嬰幼兒配方奶粉作為母乳的最佳替代品。然而,長期喝母乳的嬰兒很難在短期內(nèi)適應(yīng)配方奶粉的風味,因此測定母乳所特有的揮發(fā)性成分具有重要意義。近年來對母乳的研究主要集中于對母乳中某些特定營養(yǎng)成分的研究,比如脂肪酸、核苷酸、免疫因子等活性物質(zhì)[1317],對母乳揮發(fā)性物質(zhì)的研究還未見相關(guān)報道。

本研究采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法(SPMEGCMS)測定母乳的揮發(fā)性物質(zhì),通過單因素實驗法對萃取頭的選擇、萃取量、鹽效應(yīng)、萃取溫度和時間、解析時間進行優(yōu)化,從而得到母乳揮發(fā)性成分SPMEGCMS檢測的較優(yōu)條件,揭示影響母乳風味的主要揮發(fā)性成分,為母乳配方奶風味的改進提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮母乳 源于產(chǎn)后6個月的28歲母親,放置于母乳保鮮袋中,于4度冰箱保存；NaCl 分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

萃取頭:100 μm PA(polyacrylate),100 μm PDMS(polydimethylsiloxane),75 μm CAR/PDMS(carboxenpolydimethylsiloxane),65 μm DVB/PDMS(divinylbenzenpolydimethylsiloxane),50/30 μm CAR/DVB/PDMS(carboxendivinylbenzenpolydimethylsiloxane)涂層的萃取頭 美國Supelco公司;三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GCMS) TriPlus RSHTrace GC ULTRATSQ Quantum XLS 全自動進樣氣相色譜(三重四級桿)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 萃取頭老化方法 將使用的五種固相萃取頭設(shè)置于TriPlus上的Fiber Conditioning Station中老化至沒有雜峰,老化溫度250 ℃,老化時間30 min。

1.2.2 萃取條件 取適量的液體母乳于20 mL的螺口玻璃瓶中,加入適量的NaCl,在TriPlus的Agitator中設(shè)置適當?shù)臏囟绕胶? min,插入固相萃取頭吸附平衡,最后于GC進樣口解析。本實驗中分別選用了100 μm PA,100 μm PDMS,75 μm CAR/PDMS,65 μm DVB/PDMS,50/30 μm CAR/DVB/PDMS五種萃取頭進行實驗,母乳萃取量為4 mL,NaCl加入量為1.0 g,在45 ℃下恒溫萃取30 min,解析時間5 min,研究不同萃取頭對萃取效果的影響;根據(jù)萃取頭的優(yōu)化結(jié)果,選用DVB/PDMS,萃取溫度40 ℃,萃取30 min,解析5 min,母乳的萃取量為1、2、3、4、5、6 mL,研究萃取量對總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,分別加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g NaCl固體,充分混勻至NaCl能夠溶解或飽和,萃取溫度40 ℃,萃取時間30 min,解析時間5 min,研究鹽效應(yīng)對總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,分別在40、45、50、55、60、65 ℃萃取30 min,解析5 min,研究萃取溫度對總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,在60 ℃下分別萃取10、20、30、40、50、60 min,解析5 min,研究萃取時間對總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,在60 ℃萃取30 min,分別解析1、3、5、7、9、11 min,研究解析時間對總峰面積及出峰數(shù)的影響。所有樣品3次平行。

1.2.3 GCMS參數(shù)條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:毛細管色譜柱(TR-WAXMS 30 m×0.25 mm×0.25 mm);升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min上升至120 ℃,再以10 ℃/min上升至240 ℃,保持8 min。載氣是高純氦氣,流速是1.0 mL/min;不分流模式,進樣口溫度為250 ℃,傳輸線溫度為240 ℃[18]。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源:電子能量70 eV;離子源溫度是240 ℃;燈絲電流50 μA;質(zhì)量掃描范圍(m/z):33～450 u[18]。

1.2.4 定性定量方法 定性方法:經(jīng)過軟件檢索,同時結(jié)合NIST library的配比度,本實驗僅對相似度大于800(最大值是1000)的鑒定結(jié)果進行分析。定量方法:根據(jù)峰面積歸一化計算[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取頭的優(yōu)選

不同萃取頭由于其涂層極性的不同,所能吸附的物質(zhì)種類和極性也不同。極性涂層對酸類和酚類物質(zhì)等極性物質(zhì)有較好的吸附性,非極性涂層對非極性物質(zhì)具有較好的吸附效果,因而不同類型的物質(zhì)需要選擇合適的萃取頭進行實驗。通過單因素方差分析,不同的萃取頭對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖1所示,DVB/PDMS所得到物質(zhì)的總峰面積及出峰數(shù)遠遠高于PA、PDMS和CAR/PDMS,比CAR/DVB/PDMS略高。可能的原因是DVB/PDMS萃取頭具有兩極性質(zhì)[19],對多種物質(zhì)具有好的吸附效果,因此萃取頭的選擇類型為DVB/PDMS。

圖1 萃取頭的種類對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction fibers on extraction efficiency

2.2 萃取量對萃取效果的影響

本實驗所用的萃取瓶的總?cè)莘e是20 mL,母乳萃取量的多少會影響萃取揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積及出峰數(shù)。如果樣品量太少,萃取頭得不到充分的吸附,萃取的揮發(fā)性物質(zhì)就少;如果樣品量過多,則由于樣品擠壓沒有充分的揮發(fā)面積和萃取頭無法過量吸附,導(dǎo)致萃取的揮發(fā)性物質(zhì)在一定萃取量之后趨于平穩(wěn)或者有所下降。通過單因素方差分析,不同的樣品量對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖2所示:萃取量的增大引起總峰面積及出峰數(shù)也隨之增大;當萃取量達到5 mL時出現(xiàn)最大總峰面積及出峰數(shù),當萃取量達到6 mL時,總峰面積沒有明顯的上升(p>0.05)且出峰數(shù)略有下降。因此母乳較優(yōu)的萃取量為5 mL。

圖2 萃取量對萃取效果的影響Fig.2 Effect of sample volumes on extraction efficiency

2.3 鹽效應(yīng)對萃取效果的影響

為了提高萃取的靈敏度,通常通過采用鹽析手段來提高基體溶液中的極性有機化合物在吸附涂層中的吸附系數(shù)從而達到更高的吸附率,但無機鹽的過量加入會增加基質(zhì)的黏度,降低物質(zhì)的擴散速度,產(chǎn)生負效應(yīng)[20]。通過單因素方差分析,不同NaCl的添加量對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖3所示:NaCl含量的增多引起總峰面積也相應(yīng)升高,當NaCl含量達到1.5 g 時總峰面積及出峰數(shù)最高,之后趨于平衡,這說明1.5 g NaCl在5 mL的樣品中使揮發(fā)性有機物達到最大逸出量,因此在5 mL的母乳中選擇1.5 g NaCl為宜。

圖3 NaCl的添加量對萃取效果的影響Fig.3 Effect of additive amount of sodium chloride on extraction efficiency

2.4 萃取溫度對萃取效果的影響

萃取溫度也會影響總峰面積且具有雙重影響。一方面,隨著溫度的升高,增強被萃取物的揮發(fā)性,進而提高分析物在頂空中的分配,減少平衡時間,提高分析速率;另一方面,溫度過高使得萃取頭的固有涂層脫附,降低分析物在涂層與樣品中的分配系數(shù),從而減少萃取頭的吸附量,影響總峰面積。通過單因素方差分析,不同的萃取溫度對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖4所示:伴隨著溫度的升高,總峰面積和出峰數(shù)相繼增大,當溫度升到60 ℃時,總峰面積和出峰數(shù)達到最高值隨后下降,因此較優(yōu)的萃取溫度是60 ℃。

圖4 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.5 萃取時間對萃取效果的影響

萃取時間的長短跟樣品的分配系數(shù)、揮發(fā)物質(zhì)的擴散速度、萃取頭的種類和膜厚及其吸附能力、樣品的體積等因素有著密切的關(guān)系。結(jié)果如圖5所示:萃取時間的延長引起總峰面積和出峰數(shù)快速增大(p<0.01),30 min時達到最大值,而后有所減小。這表明過長時間的萃取可能造成組分之間的化學(xué)反應(yīng),不僅影響萃取效果,還對萃取頭有一定的影響。此實驗中,較優(yōu)的萃取時間為30 min。

圖5 萃取時間對萃取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.6 解析時間對GCMS檢測的影響

解析時間與萃取頭的膜厚、長短及解析的完全程度相關(guān),萃取頭越長或膜厚越厚,其解析時間一般有所增加。若解析不完全則會影響方法的靈敏度,同時也會影響下一個樣品的檢測分析。若解析時間過度則會對萃取頭有一定的損害。通過單因素方差分析,不同的解析時間對GCMS檢測具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖6所示:解析時間的延長引起總峰面積及出峰數(shù)繼而增大,在解析5 min之后峰面積變化不大(p>0.05),因此較優(yōu)的解析時間選擇為5 min。

圖6 解析時間對GCMS檢測的影響Fig.6 Effect of desorption duration on GCMS detection

2.7 母乳揮發(fā)性成分分析

在上面篩選出的較優(yōu)條件下對母乳揮發(fā)性成分進行了測定,揮發(fā)性成分及相對含量見表1。分析得到34種揮發(fā)性成分,其中烯烴類最多,有14種(總含量為74.97%),其中右旋萜二烯和萜品烯的含量分別占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的47.68%和12.44%;酸類有5種(總含量為15.54%)、相對含量較高的有癸酸(6.77%)和辛酸(5.43%);酯類有8種(總含量為4.25%),相對含量較高的是癸酸乙酯(1.13%);芳香烴類有4種(總含量為3.91%),相對含量較高的為二甲苯(2.53%);酮類3種(總含量為1.33%),相對含量較高的為乙偶姻(0.8%)。由此可見右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要揮發(fā)性成分,酸類、酯類、芳香烴類和酮類是母乳特殊風味的重要組成部分。

表1 母乳的揮發(fā)性成分及其相對含量Table 1 Volatile compounds and relative contents of breast milk

羊奶中含有42種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類物質(zhì)最多,有14種,包括10種短鏈脂肪酸,含量較高的是己酸、辛酸和癸酸,占揮發(fā)性成分的68%,可能和羊奶特有的膻味有關(guān)[18]。除了酸類物質(zhì)外,還含有6種酯類物質(zhì),和羊奶特殊的香氣有關(guān)[18]。此外,揮發(fā)性物質(zhì)還包括烷烴、芳香族、醇、醛酮和雜環(huán)類化合物,相對含量較高的有丙酮、苯甲醛等[18]。酸牛奶揮發(fā)性物質(zhì)主要有酸類(28%)和酮類(29%),酸類物質(zhì)對酸牛奶的風味強度影響較大,酮類物質(zhì)賦予酸牛奶特征性的風味,屬于酮類物質(zhì)的乙偶姻是酸牛奶中含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)(13.4%)[21]。

3 結(jié)論

本研究利用單因素實驗分析了影響SPMEGC-MS檢測的6個因素,確定了母乳揮發(fā)性成分的檢測條件為DVB/PDMS萃取頭、樣品量 5 mL、添加 1.5 g NaCl、萃取溫度60 ℃、萃取時間30 min、解析時間5 min,在此較優(yōu)檢測條件下分析得到34種揮發(fā)性成分,其中烯烴類14種、酸類5種、酯類8種、芳香烴類4種、酮類3種。右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要揮發(fā)性成分,本研究將為改善配方奶的風味提供一定的理論依據(jù)。

[1]Jeurink P V,van Bergenhenegouwen J,Jimenez E,et al. Human milk:A source of more life than we imagine[J]. Beneficial Microbes,2013,4(1):1730.

[2]Jacobi S K,Odle J. Nutritional factors influencing intestinal health of the neonate[J]. Advances in Nutrition,2012,3(5):687696.

[3]Newburg D S,Ruizpalacios G M,Morrow A L.Human milk glycans protect infants against enteric pathogens[J].Annual Review of Nutrition,2005,25(25):3758.

[4]Collado M C,Rautava S,Isolauri E,et al. Gut microbiota:A source of novel tools to reduce the risk of human disease?[J]. Pediatric Research,2015,77(1/2):182188.

[5]張道文,劉超,蔡可英. 母乳喂養(yǎng)對兒童期肥胖的影響[J].國際內(nèi)分泌代謝雜志,2013,33(1):2931.

[6]Hassiotou F,Geddes D T. Immune cellmediated protection of the mammary gland and the infant during breastfeeding[J]. Advances in Nutrition,2015,6(3):267275.

[7]趙潔,孫天松. 母乳對嬰兒腸道菌群及免疫系統(tǒng)影響的研究進展[J].食品科學(xué),2017,38(1):289296.

[8]Mohammed A,Hartmann P E,Geddes D T,et al. MicroRNAs in breast milk and the lactating breast:Potential immunoprotectors and developmental regulators for the infant and the mother[J]. International Journal of Environmental Research & Public Health,2015,12(11):1398114020.

[9]PerezCano F J,Dong H,YAQooB P.Invitroimmunomodulatory activity ofLactobacillusfermentum CECT5716 andLactobacillussalivariusCECT5713:Two probiotic strains isolated from human breast milk[J]. Immunobiology,2010,215(12):9961004.

[10]GomezGallego C,Frias R,Bernal M J,et al.Polyamine supplementation in infant formula:Influence on lymphocyte populations and immune systemrelated gene expression in a Balb/cOlaHsd mouse model[J].Food Research International,2014,59(4):815.

[11]Yu Z T,Chen C,Kling D E,et al. The principal fucosylated oligosaccharides of human milk exhibit prebiotic properties on cultured infant microbiota[J].Glycobiology,2013,23(2):169177.

[12]Yu Z T,Chen C,Newburg D S. Utilization of major fucosylated and sialylated human milk oligosaccharides by isolated human gut microbes[J]. Glycobiology,2013,23(11):12811292.

[13]LópezLópez A,LópezSabater MC,CampoyFolgoso C,et al.Fatty acid and sn2 fatty acid composition in human milk from Granada(Spain)and in infant formulas[J].European Journal of Clinical Nutrition,2002,56(12):12421254.

[14]Martin J C,Bougnoux P,Antoine J M,et al.Triacylglycerol structure of human colostrum and mature milk[J].Lipids,1993,28(7):637643.

[15]Fidler N,Koletzko B.The fatty acid composition of human colostrums[J].European Jonrnal of Nutrition,2000,39(1):3137.

[16]Koletzko B,RodriguezPalmero M.Polyunsaturated fatty adds in human milk and their role in early infant development[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,1999,4(3):269284.

[17]張婷婷,曾明飛,金燕,等.反相高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量[J]. 分析化學(xué),2014,42(4):585591.

[18]艾對,張富新,于玲玲,等. 羊奶中揮發(fā)性成分頂空固相微萃取條件的優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報,2015,34(1):4046.

[19]Filho A M,Santos F N,Pereira P A.Development,validation and application of a methodology based on solidphase micro extraction followed by gas chromatography coupled to mass spectrometry(SPME/GCMS)for the determination of pesticide residues in mangoes[J].Talanta,2010,81,346354.

[20]王海濱,徐驊,李蕓.固相微萃取技術(shù)及其應(yīng)用現(xiàn)狀綜述[J].上海環(huán)境科學(xué),2006,25(6):260262.

[21]劉南南,鄭福平,張玉玉,等. SAFEGCMS分析酸牛奶揮發(fā)性成分[J].食品科學(xué),2014,35(22):150153.