豌豆蛋白擠出物制備抗氧化肽工藝優(yōu)化及其分離

李 慧,王 琪,付 鑫,王鑫爍,周泉城,*

(1.山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院食品科學系,山東淄博 255049;2.農(nóng)產(chǎn)品功能化技術(shù)山東省高校重點實驗室,山東淄博 255049)

利用擠壓生產(chǎn)的食品，因其營養(yǎng)豐富、風味獨特、食用方便,受到廣大消費者的厚愛,因此，擠壓也逐漸成為食品加工的重要方式[1]。擠壓加工蛋白可使蛋白更易于酶解[24]。在擠壓過程中,在溫度、壓力和剪切力的作用下,使維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力減弱,使其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展,由球狀轉(zhuǎn)為纖維狀,并使分子間氫鍵、二硫鍵等化學鍵斷裂[5]。此外,擠壓后的物料游離氨基的含量增加,使得擠出物的消化率升高,蛋白質(zhì)的酶解速度加快[6]。

豌豆(PisumsativumLinn)又名麥豌豆、寒豆、麥豆,是重要的食用和飼用豆類作物,是一種營養(yǎng)性食品[7],含有的各種礦物質(zhì)對人體有極大的好處,如銅有利于造血以及骨骼和腦的發(fā)育;鉻有利于糖和脂肪的代謝,能維持胰島素的正常功能。研究表明豌豆蛋白通過酶解所獲得的豌豆蛋白肽具有一些活性功能[8]。比如,Ndiaye等[9]研究發(fā)現(xiàn)豌豆酶解液具有抗氧化、降低炎癥和免疫調(diào)節(jié)的作用。而Huan Li等的研究則表明,豌豆蛋白酶解后的產(chǎn)物為陽離子多肽,該多肽可以有效調(diào)節(jié)Ca MK II的活性,因而可以作為保健品被利用于心血管疾病的預防方面。Samson等[10]則發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白可以抑制ACE酶的活性,從而起到降血壓的作用,但現(xiàn)有研究中對豌豆蛋白肽分離提取率并不高,本研究采用響應曲面法對酶解條件進行優(yōu)化,從而得到具有較高酶解率的抗氧化肽,采用透析的方法對酶解液進行純化,使得肽的抗氧化性顯著提升。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中性蛋白酶 酶活力為47362 U/g,濟寧元素高科生物科技有限公司;豌豆蛋白粉 主要組成為水分4.6%±0.02%,蛋白質(zhì)73.2%±0.23%,粗脂肪0.22%±0.01%,灰分4.62%±0.03%,購自煙臺雙塔食品股份有限公司;OsoT8300透析袋 上海肯強儀器有限公司;三氯乙酸、乙腈 Sigma公司;Tris 天津市北方天醫(yī)化學試劑;甲醛 德州潤昕實驗儀器有限公司。

單螺桿擠壓機 山東理工大學農(nóng)業(yè)工程與食品科學學院研制,螺桿轉(zhuǎn)速:170 r/min,機筒溫度:60 ℃,膜孔孔徑:12 mm;RE200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司;FDC10N型臺式冷凍干燥機 冠森生物科技(上海)有限公司;Waters2695高效液相色譜儀 杭州賽默科技有限公司;WHZ2 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器 常州市萬豐儀器制造有限公司;112M2粉碎機 山東紅衛(wèi)電機股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同含水率豌豆蛋白的制作及其水解度的測定

1.2.1.1 制作方法 稱取2 kg豌豆蛋白粉,加水混勻,利用烘干法測定含水率,含水率公式如下:

含水率(%)=(烘干前質(zhì)量烘干后質(zhì)量)/烘干前質(zhì)量×100

使其含水率分別為20%、25%、30%和35%。在機筒溫度60 ℃,螺桿轉(zhuǎn)速為170 r/min,模孔孔徑為12 mm的條件下進行擠壓[11]。將擠出物置于常溫下冷卻，后放入烘箱中于56 ℃下烘干12 h，粉碎至100目,裝袋置于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 豌豆蛋白水解度的測定 采用甲醛滴定法[12]。水解度公式如下:

DH(%)=M(V1V2)(1000/CwoV)(1/htot)×100

式中,M為NaOH溶液的濃度(mol/L);V為用于甲醛滴定的酶解液的體積數(shù)(mL);Cwo為所使用的豌豆蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)量濃度(g/L);htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù),豌豆蛋白為7.55。

1.2.2 豌豆蛋白擠出物的酶解 稱取1 g豌豆蛋白擠出物并加入一定質(zhì)量的蛋白酶和一定pH的磷酸鹽緩沖溶液,搖勻,置于一定溫度的水浴鍋中,酶解3 h,沸水浴滅酶10 min。冷卻后,將蛋白酶解液過濾,取濾液待測,記為酶解物[14]。

1.2.3 豌豆蛋白酶解參數(shù)的響應面優(yōu)化 通過查閱資料文獻大致確定實驗因素的用量范圍,后采用單因素實驗確定各因素的顯著用量范圍[13],進而確定最優(yōu)水平,實驗因子及水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

清除率(%)=(ΔA0ΔA)/ΔA0×100

其中,ΔA0為空白組吸光度每分鐘的增值;ΔA為實驗組吸光度每分鐘的增值。

1.2.5 透析袋分離豌豆蛋白抗氧化肽 采用7、3.5、1 ku的透析袋,對酶解液進行依次分離。預處理好的透析袋中加入約三分之二的酶解液,兩端封好,放在蒸餾水中進行攪拌,每隔一段時間換一次水,直至透出液不再有顏色變化,將透出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(旋轉(zhuǎn)速度:200 r/min,溫度:60 ℃),把濃縮液冷凍干燥,得到豌豆蛋白抗氧化肽粉。

1.2.7 豌豆蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布的測定 用日立液相色譜儀Waters ProteinPak 125A 300 mm×7.8 mm色譜柱對經(jīng)透析袋分離后得到的分子量小于1 ku的組分進行分子量分布的分析。流動相:乙腈/水/三氟乙酸,45/55/0.1(V/V),檢測波長:220 nm,流速:0.5 mL/min,柱溫:30 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個操作3次平行。利用SAS 9.1軟件建立回歸模型方程,對數(shù)據(jù)進行ANOVA分析,Duncan test確定平均值差異。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 實驗原料的確定

對原豌豆蛋白及擠壓后不同含水率豌豆蛋白的水解度進行測定比較,結(jié)果如圖1所示。

圖1 豌豆蛋白及其擠出物水解度Fig.1 The DH of pea protein and its extrudate

由圖1可知,豌豆蛋白經(jīng)擠壓后,水解度明顯上升,且含水量為25%時,水解度最高,因此,本實驗采用含水量為25%的擠壓豌豆蛋白為原料。

2.2 響應面實驗結(jié)果與分析

在預實驗的基礎(chǔ)上,選取加酶量(A)、溫度(B)、pH(C)、底物濃度(D)為實驗因素,以酶解物的自由基清除率為評判指標,設(shè)計4因素5水平共26個實驗點的響應分析實驗進行二次回歸設(shè)計實驗和分析。實驗結(jié)果見表2。

表2 響應面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The design and results of response surface experiment

Y=1231.20295+4.36240A+6.24496B+344.25208C21.48021D+2.93750×10-3AB+0.59479AC+0.34719AD0.37375BC+0.025875BD+2.18125CD0.45195A20.049112B225.26736C2+0.28219D2

對回歸方程進行方差分析,結(jié)果見表3。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

圖清除率響應曲面圖Fig.2 Response surface plot of the scavenging rate of

2.3 最佳清除率條件

2.4 豌豆蛋白抗氧化肽的分離

表4 豌豆蛋白肽抗氧化活性Table 4 Antioxidant activity of pea protein peptide

2.5 豌豆蛋白酶解物小于1 ku豌豆蛋白肽的分子量分析

2.5.1 分子量校正曲線 根據(jù)不同分子量的葡聚糖從色譜柱上洗脫出來的時間不同,從而繪制出分子量校正曲線,如圖3所示。

圖3 分子量校正曲線Fig.3 Molecular weight calibration curve

校正曲線:lg(MW)=7.3820.248t,R2=0.9994,t為時間。

2.5.2 分子量小于1 ku的豌豆蛋白肽分子量分布圖 豌豆蛋白肽的分子量分布見圖4。

圖4 擠壓豌豆蛋白酶解物分子量分布圖Fig.4 Molecular weight distribution of hydrolysates of pea protein

由圖3、圖4可知,經(jīng)1 ku透析袋分離后的豌豆蛋白肽,分子量大多集中在200～800 u左右,說明酶解后得到的肽大多是2～8肽,這與相關(guān)報道結(jié)果一致[17]。

3 結(jié)論

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