基于柑橘的多酵母協同發酵料酒的制備

李 欣,付彩霞,李軍鵬,余紅波,鄒 濤,王 志,代 俊,陳 雄,陳世貴,*

(1.發酵工程教育部重點實驗室,湖北省工業發酵協同創新中心,工業微生物湖北省重點實驗室,湖北工業大學,湖北武漢 430068;2.湖北土老憨調味食品股份有限公司,湖北宜都 443302)

料酒是專門用于烹飪調味的酒,是調味品行業重要品類之一,在我國已有上千年的使用歷史[12]。日本、美國、歐洲的某些國家也有使用料酒的習慣[3]。我國的傳統料酒是用釀造黃酒浸泡香辛料制得。菌種方面,在充分利用自然微生物群系的基礎上,為提高淀粉糖化效率和葡萄糖的乙醇轉化效率,采用定向篩選技術挖掘高糖化酶活力的米曲霉和耐高溫的高產乙醇釀酒酵母[78]。

近十幾年來,隨著人民生活水平的提高和對調味品新風味的追求,水果汁或蔬菜汁等被作為新風味的來源應用于調味品的產品。這些新輔料或作為發酵原料添加到黃酒或米酒的釀造過程中以制備料酒,或作為配制原料按照一定比例與黃酒或食用酒精混合來生產料酒[910]。柑橘富含豐富的生物活性[1113]和風味物質[14],已成功用于飲料果酒[1516]和傳統釀造食品醬油[17]的生產。柑橘的應用為這些產品提供了新風味和新口感。

多菌種發酵策略是食品釀造工業中常用的策略,其最大優勢既能利用不同微生物代謝特征提供豐富的代謝產物,如各種氨基酸和有機酸,又能賦予釀造食品獨特的風味。在傳統料酒生產中,酵母處于至關重要的地位。

本文以柑橘作為發酵主要原料,采用多酵母(乙醇酵母和風味酵母)協調組合發酵技術來制備柑橘型料酒。在最適發酵條件下,主要指標達到料酒質量標準,且柑橘風味顯著,為開發柑橘型料酒產品奠定了技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

釀酒酵母(Saccharomycecerevisiae)TLH 湖北土老憨調味食品股份有限公司;魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)CCTCC M 2013310、球擬酵母(Torulopsis) 本實驗室從醬油中分離純化獲得;柑橘 湖北土老憨調味食品股份有限公司;乳酸標準品(50 mg/100 mL) 山東科學院生物研究所提供;3,5二硝基水楊酸(3,5dinitrosalicylic acid,DNS)(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司;葡萄糖(食品級) 山東祥瑞藥業有限公司;體積分數95%酒精(醫用級) 武漢興和達商貿有限公司;酵母粉、蛋白胨(生化試劑) 北京雙旋微生物培養基制品廠;YEPD培養基 酵母粉10 g,蛋白胨20 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1000 mL,pH6.0。

SBA生物傳感儀 山東省科學院生物研究所;AMR612型均質機 中國安蜜爾電器實業有限公司;BL75A型高壓滅菌鍋 上海博迅實業有限公司公司;HNY211B型恒溫搖床 天津歐諾儀器儀表有限公司;ZSDA1160A型恒溫培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司;CT15RE型離心機 日本日立公司;V1100D型可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;5804R型離心機 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 柑橘料酒制備工藝流程如圖1所示。

圖1 柑橘料酒工藝流程Fig.1 The technological process of citrus cookingwine

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 柑橘處理方法 用75%乙醇對柑橘表面進行消毒,皮肉分離,再用經75%乙醇消毒處理的均質機分別均質破碎,8000 r/min離心10 min,收集柑橘肉和柑橘皮離心液于20 ℃保存,保存期不超過4周。

1.2.2.2 酵母菌活化及酵母泥制備方法 用無菌接種環從酵母活化斜面上取一環,接入YEPD培養基中,在30 ℃、200 r/min的條件下振蕩培養18 h。培養結束后,取1 mL酵母活化液于8000 r/min離心10 min,收集離心沉淀作為酵母泥用于料酒發酵。1 mL酵母活化液所收集到的酵母泥定義為1份活化酵母泥。

1.2.2.3 活化酵母泥的加入 從發酵基液中吸取1 mL加入1份活化酵母泥中,用移液槍吹吸打散酵母泥,再全部轉移至發酵基液中。

1.2.2.4 料酒發酵方法 含有柑橘組分、酵母泥和輔料的混合液,振蕩混勻后于30 ℃條件下靜置培養144 h。

1.2.3 柑橘組分對單一酵母發酵的影響 在初始葡萄糖濃度為60 mg/mL條件下,于不同體積分數的柑橘果肉汁或/和柑橘皮汁中添加一定濃度的活化酵母泥,振蕩混勻后靜置發酵,并每隔24 h取樣進行檢測,以分析魯氏酵母、球擬酵母和釀酒酵母在不同體積分數的柑橘果肉汁或/和柑橘皮汁條件下的乙醇和乳酸積累規律。

1.2.4 協同酵母料酒發酵技術研究

1.2.4.1 初始葡萄糖濃度的確定 在同時接種混合酵母(釀酒酵母∶魯氏酵母∶球擬酵母,1份∶1份∶1份)條件下,全柑橘汁中添加不同濃度的葡萄糖(20、60、120、180和240 mg/mL),振蕩混勻后靜置發酵,并每隔24 h取樣用于檢測殘糖、乙醇和乳酸濃度。

1.2.4.2 初始酵母浸粉濃度的確定 在同時接種混合酵母(釀酒酵母∶魯氏酵母∶球擬酵母,1份∶1份∶1份)條件下,在含有60 mg/mL葡萄糖的全柑橘汁中添加不同濃度的酵母浸粉(1%、2%、3%、4%和5%),振蕩混勻后靜置發酵,并每隔24 h取樣用于檢測殘糖、乙醇和乳酸濃度。

1.2.4.3 三種酵母復配比例的確定 在含有120 mg/mL初始葡萄糖全柑橘汁中(不添加酵母浸粉),按不同復配濃度(1份∶1份∶1份、2份∶1份∶1份、1份∶2份∶1份、1份∶1份∶2份、2份∶2份∶2份)加入釀酒酵母、魯氏酵母合和球擬酵母,振蕩混勻后靜置發酵,并每隔24 h取樣用于檢測殘糖、乙醇和乳酸濃度。

1.2.4.4 三種酵母復配順序的確定 在含有120 mg/mL初始葡萄糖和1%酵母粉的全柑橘汁中,按2份∶2份∶2份的比例和表1所示的添加順序加入釀酒酵母、魯氏酵母合和球擬酵母,振蕩混勻后靜置發酵,并每隔24 h取樣用于檢測乙醇和乳酸濃度。

表1 三種酵母添加組合策略Table 1 The adding strategy of three yeasts

1.2.5 測定方法 適量發酵樣品在4 ℃、8000 r/min下離心10 min,收集上清液用于殘糖、乳酸和乙醇的測定。

采用DNS(3,5二硝基水楊酸)比色法(540 nm)測定殘糖濃度[18]。以響應值為縱坐標,葡萄糖濃度為橫坐標,建立標準方程:y=1.4597x+0.01272,偏差R2為0.999。

采用SBA生物傳感儀檢測乙醇和乳酸濃度[1920]。其中乙醇標準液的配制:將25 μL無水乙醇加入100 mL容量瓶中,并用去離子水定容,所配得乙醇質量濃度為20 mg/100 mL。現用現配。

1.3 數據處理

每組實驗3個平行。運用Excel計算平均值,并運用Origin 8.6軟件對發酵數據作圖。

2 結果與分析

2.1 柑橘組分對單一酵母發酵的影響

釀酒酵母具有顯著的乙醇合成能力[21],魯氏酵母和球擬酵母均是典型的風味形成酵母[22]。柑橘組分對微生物的生長可能存在不同的影響[2324],因此本研究分析這3種酵母在柑橘組分存在條件下的發酵能力差異,為建立組合酵母發酵生產料酒奠定基礎。同時,調味料酒中的兩個主要指標(乙醇和乳酸)被作為發酵評價的重要指標[25]。

2.1.1 柑橘組分對魯氏酵母發酵影響 在初始葡萄糖濃度為60 mg/mL時,不同體積分數的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)對魯氏酵母乙醇和乳酸積累的影響如圖2A和2B。結果表明,在發酵的0～72 h,乙醇在持續積累,72 h后乙醇濃度逐漸降低。值得注意的是,柑橘果肉汁的含量越高,發酵過程中所積累的乙醇濃度越高。這表明高濃度的柑橘果肉汁對提高乙醇濃度具有正向效果。與乙醇生成轉化不同的是,添加柑橘肉汁在0%～50%對乳酸積累的差異不大,但75%和100%柑橘肉汁濃度從48 h開始大量積累乳酸,最大乳酸積累濃度分別達到0.82和1.74 mg/mL。

圖2 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)對魯氏酵母乙醇(A和C)或乳酸(B和D)積累的影響Fig.2 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Zygosaccharomyces rouxii

添加有60 mg/mL初始葡萄糖的不同體積分數的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%或20%)對魯氏酵母發酵的影響如圖2C和2D所示。無論添加何種濃度的柑橘皮汁,其乙醇濃度均低于對照(%)。然而,在有柑橘皮汁存在情況下,除5%柑橘皮汁濃度外,乙醇的濃度都隨著發酵時間的延長而增加。同時,最大乙醇積累濃度也隨著柑橘皮濃度的提高而提高。在20%柑橘皮濃度下,最大乙醇積累濃度達到2.04 mg/mL。這些結果表明柑橘皮具有刺激魯氏酵母合成乙醇的功能。柑橘皮對魯氏酵母積累乳酸的影響與柑橘肉的作用截然不同。添加柑橘皮后,除對照和5%柑橘皮汁濃度外,乳酸水平分別在48 h(10%)、48 h和120 h(15%)、72 h(20%)達到最大,隨后其濃度幾乎維持恒定,保持在0.12～0.16 mg/mL之間。

2.1.2 柑橘組分對球擬酵母發酵影響 圖3A和3B顯示了在60 mg/mL的初時葡萄糖中添加不同體積分數的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)對球擬酵母積累乙醇和乳酸的影響。結果表明,柑橘果肉汁的添加能明顯促進球擬酵母合成乙醇。乙醇經過第一階段的緩慢積累(0～72 h,積累量為(4.00±0.50)mg/mL),和第二階段的快速積累(72～120 h),至發酵終點其濃度在(25.00±3.00) mg/mL左右。這表明柑橘果肉汁具有刺激球擬酵母合成乙醇的作用,然而,這種刺激效應并不與柑橘果肉汁濃度有正向對應關系。乳酸濃度在發酵第72 h達到最大,并在發酵后期被利用。在大部分柑橘果肉汁濃度下,最大乳酸積累量在0.30 mg/mL,除50%濃度外(0.53 mg/mL)。可見,柑橘果肉汁的添加有助于球擬酵母大量合成乙醇,且不會引起乳酸水平的提高。

圖3 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)對球擬酵母乙醇(A和C)和乳酸(B和D)積累的影響Fig.3 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Torulopsis

圖3C和3D展現了含有60 mg/mL初始葡萄糖的不同體積分數的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%、或20%)對球擬酵母積累乙醇和乳酸的影響。與對魯氏酵母的影響相似,無論添加何種濃度的柑橘皮汁,球擬酵母所積累的乙醇濃度均沒有對照高。然而,在添加有柑橘皮汁的情況下,柑橘皮汁有助于在發酵早期提高球擬酵母的乙醇產量,且產量提高程度與柑橘皮汁的添加濃度有正相關性。但在發酵48 h后,除15%柑橘皮濃度外,乙醇的濃度不再增加,甚至會有所下降。添加柑橘皮汁后,乳酸濃度表現為倒V字形變化過程,在72 h乳酸濃度達到最大。添加10%、15%和20%柑橘皮汁的發酵液中所得到的最大乳酸積累濃度相同,均在72 h達到0.30 mg/mL。這表明添加高濃度的柑橘皮汁不會促進球擬酵母大量積累乳酸。

2.1.3 柑橘組分釀酒酵母發酵料酒影響 含有60 mg/mL的初始葡萄糖的不同體積分數的柑橘果肉汁(0%、25%、50%、75%或100%)對釀酒酵母積累乙醇和乳酸的影響如圖4A和4B。無論是何種柑橘果肉汁濃度,在整個發酵周期,乙醇的濃度經歷了緩慢增長(0～72 h)、快速積累(72～96 h)、快速降低(96～120 h)和維持穩定(120～144 h)四個變化階段,而且乙醇的最大積累濃度與柑橘果肉汁體積分數的增長表現為正相關性。最大柑橘果肉汁體積分數下,其最大乙醇積累濃度為138.00 mg/mL(96 h)。無論添加多少柑橘果肉汁,乳酸在發酵早期都會持續積累,但在發酵的72～96 h期間,乳酸濃度都維持在0.10 mg/mL的水平上,隨后其濃度逐漸降低。

圖4 柑橘果肉汁(A和B)或柑橘皮汁(C和D)對釀酒酵母乙醇(A和C)和乳酸(B和D)積累的影響Fig.4 Effect of the citrus fruit(A,B)or peel(C,D)concentration on ethanol(A,C)and lactate(B,D)content of Saccharomyce cerevisiae

含有60 mg/mL的初始葡萄糖的不同體積分數的柑橘皮汁(0%、5%、10%、15%或20%)對釀酒酵母積累乙醇和乳酸的影響如圖4C和4D。乙醇的大量積累發生在72～96 h,隨后乙醇濃度快速下降。對乙醇而言,柑橘皮汁最佳添加濃度為10%,其最大乙醇積累濃度接近180 mg/mL。值得注意的是,在72～96 h發酵階段積累的乙醇濃度與96～120 h階段所減少的濃度非常相近,前者平均值為123.40 mg/mL,后者平均值為119.60 mg/mL,這表明發酵的有效積累乙醇濃度并不高。雖然柑橘皮汁的對釀酒酵母乙醇合成的刺激作用明顯,但發酵液中乙醇水平不穩定,使得發酵終點的乙醇濃度達不到目標。在不添加柑橘皮汁時,最大乳酸積累量首次出現在發酵第72 h。添加柑橘皮汁后,除20%條件外,其余3種條件下的乳酸濃度都在48 h達到最大,且在隨后的發酵期間,乳酸濃度均在(0.10±0.02) mg/mL波動,與對照處于相似的水平。這樣的結果表明柑橘皮汁對釀酒酵母發酵期間的乳酸沒有影響。

為充分利用釀酒酵母和風味酵母(魯氏酵母和球擬酵母)的特性,為進一步提高乙醇的濃度,混合酵母發酵柑橘料酒。上述研究結果表明柑橘果肉汁比柑橘皮汁更有利于料酒發酵,能有效提升3種酵母的乙醇合成水平。因此后續研究采用全柑橘汁(100%)作為發酵基液,并進一步優化了料酒發酵的工藝條件,包括葡萄糖和酵母粉的初始濃度、三種酵母的復配比例和濃度及添加順序等。

2.2 協同酵母料酒發酵技術研究

2.2.1 初始葡萄糖濃度優化 釀酒酵母、魯氏酵母和球擬酵母對葡萄糖均有良好的利用能力。為避免三種酵母共酵條件下出現碳源不足從而導致生長代謝活性的減弱，本研究首先優化了初始葡萄糖濃度。圖5A顯示，初始葡萄糖濃度越高，殘留的葡萄糖濃度越高，這表明三種酵母的共存并沒有完全利用葡萄糖。這可能是三種酵母的生長受到某種相同因素的限制。圖5A顯示,初始葡萄糖濃度越高,殘留的葡萄糖濃度越高,這表明同時添加三種酵母會降低葡萄糖的利用率。這可能是三種酵母的生長受到某種相同因素的限制。

圖5 不同初始葡萄糖濃度對混合酵母發酵過程中殘糖(A)、乙醇(B)和乳酸(C)的影響Fig.5 Effects of different initial glucose concentration on residual sugar(A),ethanol(B)and lactic acid(C) in mixed yeast fermentation process

圖5B結果顯示,當葡萄糖濃度從20 mg/mL提高到60、120 mg/mL時,乙醇的濃度并沒有同步增加,最大乙醇濃度不超過6.00 mg/mL。然而,當葡萄糖濃度繼續提高到180、240 mg/mL后,乙醇開始大量積累,最大乙醇濃度分別達到9.20、13.20 mg/mL。這些結果表明,三種酵母在高濃度和低濃度葡萄糖下可能具有截然不同的代謝和相互作用。可見,高濃度的初始葡萄糖濃度更有利于乙醇的大量積累。

圖5C顯示,在發酵前中期(0～96 h),除60、120 mg/mL初始葡萄糖濃度條件下的乳酸濃度幾乎檢測不到,其它條件下的乳酸濃度在0.06 mg/mL上下振蕩。然而,發酵96 h后,初始葡萄糖濃度20 mg/mL中的乳酸濃度開始大幅上升至0.28 mg/mL,其它濃度條件下的乳酸濃度或下降或檢測不到。表明高濃度的初始葡萄糖會抑制乳酸的積累。這可為我們調控發酵過程中的乳酸積累量提供了一種手段。

義109-3井固井技術研究……………………………………………………………………………桂成梁，孫 鈺，趙清忠（1.8）

2.2.2 初始酵母浸粉濃度對料酒發酵影響 圖6A顯示,在不加入酵母浸粉時,發酵終點的殘糖濃度為28.76 mg/mL。但添加1%酵母浸粉后,60 mg/mL葡萄糖在72 h被消耗完。當進一步提高酵母浸粉的濃度,葡萄糖消耗更迅速,24 h即被消耗完?？梢?酵母浸粉能促進混合發酵過程中酵母對葡萄糖利用。同時,添加酵母浸粉也顯著提高了乙醇的積累量,如圖6B。然而,無論添加多大濃度的酵母浸粉,發酵過程中的最大乙醇積累濃度均在20 mg/mL左右。值得注意的是,整體趨勢上，除對照外,酵母浸粉初始濃度越高,發酵終點的乙醇濃度越低。乳酸積累濃度與酵母浸粉濃度表現出正相關性關系。5%的酵母浸粉濃度下的最大乳酸積累量達到2.09 mg/mL,而1%的酵母浸粉中只有0.78 mg/mL的最大乳酸積累量。

圖6 不同初始酵母浸粉濃度對混合酵母發酵過程中殘糖(A)、乙醇(B)和乳酸(C)的影響Fig.6 Effects of different initial yeast powder concentration on residual sugar(A),ethanol(B)and lactic acid(C) in mixed yeast fermentation process

綜合初始葡萄糖和酵母粉的實驗結果,在同時添加釀酒酵母、魯氏酵母和球擬酵母進行共發酵條件下,初始葡萄糖濃度不低于120 mg/mL,而初始酵母浸粉濃度不高于1%,既滿足乙醇的大量積累,也能避免乳酸的積累。

2.2.3 組合酵母的添加量對料酒發酵影響 由圖7A可知,在發酵期間,葡萄糖被持續消耗。三種酵母不同復配比例的差異主要體現在發酵終點的殘糖上。同時提高三種酵母的接種量所殘留的葡萄糖濃度最少,為36.54 mg/mL(接近初始葡萄糖濃度的1/4),而只提高魯氏酵母的接種量所殘留的糖濃度是最高的,為66.52 mg/mL(幾乎為初始葡萄糖濃度的一半)。

圖7 組合酵母添加量(釀酒酵母∶魯氏酵母∶球擬酵母)對葡萄糖消耗(A)、乙醇(B)和乳酸(C)積累的影響Fig.7 Effect of different adding concentration of three yeasts(S. cerevisiae,Z.rouxii and Torulopsis)on glucose consumption(A),ethanol(B)and lactate concentration(C)

無論提高何種酵母細胞的添加量都能明顯增加發酵液中乙醇的水平,而三種酵母的添加量都提高到2%所獲得乙醇濃度最大(19.20 mg/mL左右)。更重要的是,三種酵母接種量同時提高后,乙醇濃度在發酵后期沒有明顯的下降,這將非常有利于料酒的發酵。提高任意一種酵母的接種量都會導致乳酸濃度的增加,但是同時提高三種酵母的接種量卻不會造成乳酸積累最大化,反而只是提高球擬酵母的接種量能明顯促進乳酸的積累,其最大積累濃度為0.18 mg/mL。

2.2.4 酵母添加順序對料酒發酵影響 上述研究結果顯示出,在同時添加釀酒酵母、球擬酵母和魯氏酵母情況下,三種酵母之間可能存在相互影響。為掌握三種酵母之間的互作規律,三種酵母的添加比例順序被優化。實驗參數采用上述確定的發酵最優初始條件:在1 L全柑橘汁中添加160 g葡萄糖和10 g酵母浸粉。實驗設計和結果如表2。結果表明,單一降低釀酒酵母的接種量,都將導致發酵終點的乙醇濃度降低。同時,三種酵母的添加順序對發酵終點的乳酸濃度沒有顯著影響,所有實驗組中的乳酸濃度都分布在0.11～0.14 mg/mL。但是,三種酵母的添加比例和順序對發酵終點的乙醇濃度卻有顯著的影響。最佳添加比例和順序為:在發酵初期加入2%釀酒酵母細胞活化液,在發酵第24 h再加入2%球擬酵母細胞活化液,最后在發酵第48 h加入2%魯氏酵母細胞活化液。在此工藝下,發酵終點的乙醇濃度達到145.00 mg/mL。

表2 不同時間點添加酵母對釀造產乙醇和乳酸的影響Table 2 Effect of the addition of yeasts at different time point on ethanol and lactate content

3 結論

柑橘肉汁和柑橘皮汁對魯氏酵母、球擬酵母和釀酒酵母發酵料酒具有差異性影響。添加一定柑橘肉汁和柑橘皮汁均能刺激魯氏酵母提高乙醇和乳酸的積累量。柑橘肉汁有利于球擬酵母積累乙醇,而柑橘皮汁會抑制乙醇的積累。當使用釀酒酵母時,柑橘肉汁對乳酸的影響比較大,而柑橘皮汁除了能刺激酵母利用糖外,對乙醇和乳酸無大的影響?？梢?柑橘肉汁比柑橘皮汁更適合作為料酒發酵基液,有利于提高乙醇濃度并控制乳酸的積累。在料酒發酵過程中,可以將釀酒酵母作為乙醇的主要來源,而三種酵母菌的混合使用不會引起乳酸的大量積累。

通過研究初始葡萄糖和酵母浸粉濃度、三種酵母組合添加工藝等因素對發酵過程中的殘糖、乙醇和乳酸積累的影響,確定柑橘型料酒的最優發酵初始條件為:1 L全柑橘肉汁中添加的160 g葡萄糖和10 g酵母粉;三種酵母的接種濃度和體積比例為2∶2∶2;組合酵母最佳添加順序為:釀酒酵母在發酵初期就加入,發酵24 h加入球擬酵母,并繼續發酵24 h后加入魯氏酵母。在此最適條件下靜置發酵168 h后,乙醇和乳酸的濃度分別達到145.00和0.11 mg/mL。本研究結果為柑橘料酒產品的開發提供了理論基礎和實踐指導。

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