青貯用拮抗黃曲霉并降解黃曲霉毒素菌株的篩選與鑒定

張舒月，鄭婧萱，郭曉軍，薛曉華，李銘雪，朱寶成

（河北農業大學生命科學學院，河北保定 071000）

青貯飼料中黃曲?霉毒素的污染是一個全球性問題，為青貯飼料中霉菌毒素評定的主要指標（孟慶祥等，2016）。 其中黃曲霉毒素 B1（AFB1）被世界衛生組織列為毒物之首，定為IA類致癌物質，給動物生產性能和人類健康帶來巨大的威脅 （喬宏興等，2017）。因此，青貯飼料中黃曲霉毒素的去除是反芻動物養殖者和科研機構重點關注的內容。

黃曲霉毒素常見的脫毒方法包括物理法、化學法和生物法。但是理化方法會對青貯飼料的質量和營養有不同程度的影響，甚至會引起污染。相較之下生物法應是最優的選擇，生物脫毒主要有酶解法和微生物發酵法。酶解法近年來研究較多，但微生物降解酶的機理不明確、分離純化過程復雜、酶的活性不穩定、酶作用條件苛刻等，難以在實際生產中推廣和應用（計成等，2010）。目前，微生物法降解黃曲霉毒素已成為研究的熱點，但主要集中在利用微生物發酵過程中產生的代謝產物進行脫毒，而通過生物競爭原理抑制黃曲霉生長從而降低霉菌毒素的產生和積累研究相對較少。由于黃曲霉毒素既可在作物田間生長時產生也可在倉儲期間產生，所以如果篩選到拮抗黃曲霉生長并且降解黃曲霉毒素的雙功能菌株，在青貯飼料中黃曲霉毒素的脫毒方面將具有很好的應用前景。

本試驗擬通過平板擴散法和酶聯免疫法篩選拮抗黃曲霉生長且降解黃曲霉毒素的菌株，并對活性較高的菌株進行性質研究和種屬鑒定，為新型青貯劑的研制提供更多的毒素降解微生物種質資源。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品牛糞、全株玉米青貯、土壤、牛奶、實驗室保存的菌株等。

1.1.2試驗菌株黃曲霉（Aspergillus flavus），由河北農業大學真菌毒素與分子病理學實驗室提供。

1.1.3培養基發酵培養基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉8.5 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、葡萄糖 1 g/L，pH 6.5

香 豆 素 培 養 基 ：KH2PO40.25 g/L、MgSO40.205 g/L、KNO30.5 g/L、 （NH4）2SO40.5g/L、CaCl20.004 g/L、FeCl30.002 g/L，pH 7.0， 加入 1 g 香豆素，固體培養基加入2%的瓊脂粉。

1.1.4試劑香豆素，COOLABER科技有限公司；黃曲霉毒素標準品，美國Sigma公司；黃曲霉毒素試劑盒，北京華安麥科生物技術有限公司；PCR相關試劑，北京全式金生物技術有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2方法

1.2.1菌株的分離稱取土壤、牛糞等樣品各10.0 g，分別加到裝有100mL無菌水的三角瓶中，放于37℃，180 r/min搖床中30min。吸取混勻后的溶液1.0mL于裝有9.0mL無菌水的試管中，用漩渦振蕩儀混勻，將混勻液逐級稀釋至10-7濃度。

分別吸取各種樣品稀釋度為10-5～10-7的溶液100μL均勻涂布在NA培養基平板上，37℃培養24 h后挑選菌落形態各不相同的單菌落劃線從而進一步純化，培養后觀察菌落形態并編號記錄，挑選單菌落接種至相應的斜面，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2菌株初篩挑取保存在斜面上的菌株，分別點接在香豆素培養基上，37℃培養，如有菌落長出，則在香豆素培養基上傳代3次，如傳代3次仍生長，則記錄該菌株編號，進入后續試驗。

1.2.3菌株復篩制作病原菌平板，待平板凝固后，使用直徑為1 cm的打孔器打孔。將初篩得到的菌株分別接種至NB培養基，37℃搖床培養12 h，以5%接種量轉接至發酵培養基，37℃培養48 h。 取發酵液1.5mL，10000 r/min離心 10min，取上清液80μL注入病原菌平板的孔中，放在37℃的培養箱中培養，觀察是否有抑菌圈的出現，并記錄抑菌圈的直徑。

選擇抑菌圈直徑較大的菌株接種NB培養基，37℃培養12 h后，轉接到含AFB110μg/mL的發酵培養基中，37℃培養3 d。通過酶聯免疫試劑盒檢測發酵液中剩余的AFB1濃度，并計算AFB1降解率。

1.2.4菌株的鑒定

1.2.4.1菌株的形態學鑒定對菌落大小、菌落顏色、菌落質地、菌落邊緣等特征進行鑒別。

1.2.4.2菌株的分子生物學鑒定利用PCR技術對菌落16S rDNA進行擴增，并將純化的PCR產物送測序公司進行測序分析。將測序結果用BLAST軟件與GenBank中已登錄的16S rRNA基因序列進行同源性比較，通過CLUSTALX和BIOEDIT等軟件進行多重序列比對分析，并以Neighbor-joining法構建系統發育樹（王偉等，2014）。

1.2.4.3菌株的生理生化試驗根據16S rDNA序列分析的結果，對供試菌株進行生理生化試驗，包括硝酸鹽還原、厭氧生長、淀粉水解、明膠液化、V-P測定、D-甘露醇發酵和丙酸鹽利用等。

1.2.5菌株的性質研究

1.2.5.1菌株的pH耐受性制備種子液，按6.0%的接種量接種于 pH 分別為 3.5、4.5、5.5、6.5的發酵培養基中，37℃、180 r/min搖床培養2 d后，測定菌株的生物量。

1.2.5.2菌株的溫度耐受性制備種子液，按6.0%的接種量接種于發酵培養基中，分別在17、27、37、47 ℃，180 r/min搖床培養 2 d后， 測定菌株的生物量。

2　結果與分析

2.1菌株的分離及初篩共分離得到120株菌，其中45株菌可以在以香豆素為唯一碳源的培養基上生長。

2.2黃曲霉拮抗試驗病原菌平板擴散法顯示初篩獲得的45株菌中有20株菌有抑菌圈。將抑菌圈的大小作為抑菌能力強弱的評判標準，通過量取透明圈的直徑，共得到拮抗活性較高的菌株11株，如表1所示。

表1　菌株抑菌圈大小

2.3黃曲霉毒素降解試驗通過酶聯免疫試劑盒測定11株菌對AFB1的降解率，結果見表2。11株拮抗菌株對AFB1的降解率集中在60%～95%，N-1a的降解率最高，為95%。故選擇該菌株作為待測菌株進行下一步試驗。

表2　菌株對AFB1的降解率%

2.4菌株的種屬鑒定

2.4.1菌株的形態學鑒定菌株N-1a的菌落形態呈中間微凹狀，四周隆起，乳白色，不透明。菌體呈直桿狀，常以鏈狀排列，革蘭氏染色呈陽性，存在運動性，無莢膜，芽孢呈橢圓形。

2.4.2菌株的分子生物學鑒定將菌株N-1a的16S rDNA序列與GenBank中所有已測定的原核生物的16S rDNA序列進行比對，使用PHYLIP program package軟件處理所得數據，得到了該菌株及相應標準菌株的進化距離并構建了系統發育樹，見圖1。由比對結果可知，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）聚到了一起。

圖1　基于16S rDNA序列同源性的菌株N-1a的系統發育樹

2.4.3菌株的生理生化鑒定由于在系統發育樹中N-1a與枯草芽孢桿菌聚到了一起，故選擇枯草芽孢桿菌相關的項目進行生理生化試驗，結果見表3。結果顯示，菌株N-1a與枯草芽孢桿菌生理生化結果相一致，結合細菌菌落菌體形態和16S rDNA序列分析結果最終判定該菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.5性質研究

2.5.1pH耐受性菌株N-1a在pH為 6.5、5.5、4.5和3.5時呈現不同的生長情況，如圖2所示，隨著pH的降低菌體濃度略有降低，但在pH為3.5時菌體濃度仍可達到108cfu/mL，表明該菌株具有較強的耐酸能力。

表3　生理生化試驗結果

圖2　菌株的pH耐受性

2.5.2溫度耐受性菌株 N-1a在 17、27、37℃和47℃均能生長，這樣就能滿足南北方不同氣溫下的青貯試驗。如圖3所示，菌株N-1a在37℃時生長量達到最高值，在27℃和47℃時菌體濃度仍能達到108～109cfu/mL。

圖3　菌株的溫度耐受性

3　討論

Gonzalez等（2008）報道，玉米青貯前的霉菌含量超過了104cfu/mL，其中，污染類型以曲霉屬為主，這與Keller等（2012）研究青貯飼料樣品中霉菌污染情況一致。目前黃曲霉毒素對食品和飼料危害極其嚴重，然而在去除方法中，物理、化學脫毒的方法存在營養成分流失，脫毒不徹底的缺點。本研究采用微生物法，不僅避免了這些缺點，而且條件溫和、安全環保，國內外研究表明微生物脫毒法擁有廣闊的開發和應用前景。

由于黃曲霉毒素毒性較大，若直接用于篩選菌株，可能會威脅到人體的健康，而且黃曲霉毒素價格也相對較貴，所以本試驗采用與其結構相似的香豆素為唯一碳源進行菌株的初篩。相比而言，香豆素的毒性較低，價格較低廉。李超波等（2012）利用此法篩選到10株能夠在香豆素平板上正常生長的降解黃曲霉毒素的菌株，戴軍等（2014）利用此法篩選得到27株高效降解毒素的菌株。所以香豆素作為初篩底物來篩選降解黃曲霉毒素的菌株，不僅毒性大大減弱，而且方便準確。

近年來已有利用黑曲霉（李冰等，2012）、枯草芽孢桿菌（孫玲玉，2014）、施氏假單胞菌F4（李超波等，2012）降解黃曲霉毒素的報道，但是降解率大多都集中在85%左右。本研究篩選到的菌株N-1a對黃曲霉毒素的降解率達到95%，優于先前其他研究。本試驗菌株N-1a經鑒定為枯草芽孢桿菌，為國家飼料添加劑目錄中的安全菌株，并且該菌株還具有對黃曲霉的拮抗活性，應用于青貯時可以達到對黃曲霉毒素防治結合的效果。

品質好的青貯玉米在青貯過程中pH會降低到4.0以下，北方地區進行玉米青貯時，秋季溫度會低于20℃，故青貯菌株應具有耐低pH、耐高低溫的性質。本試驗篩選菌株N-1a在pH 3.5及溫度為17℃和47℃時生長情況均良好，是一株潛在的微生物青貯菌劑。

4　結論

本試驗獲得一株具有較高拮抗黃曲霉、降解黃曲霉毒素活性的枯草芽孢桿菌菌株，該菌株在pH 3.5～6.5和溫度17～47℃時生長情況均良好。

[1]戴軍，邵帥，王常高，等.產黃曲霉毒素 B1降解酶菌株的篩選鑒定及發酵條件優化[J].工業微生物，2014，44（6）：54 ～ 59.

[2]計成，趙麗紅.黃曲霉毒素生物降解的研究及前景展望[J].動物營養學報，2010，22（2）：241 ～ 245.

[3]李冰，董征英，常維山.黑曲霉對黃曲霉毒素B1的降解與應用研究[J].飼料博覽，2012，11：6 ～ 10．

[4]李超波，李文明，楊文華，等.黃曲霉毒素B1降解菌的分離鑒定及其降解特性[J].微生物學報，2012，52（9）：1129 ～ 1136.

[5]孟慶祥，楊軍香.全株玉米青貯制作與質量評價[M].北京：中國農業科學技術出版社，2016.

[6]喬宏興，姜亞樂，王永芬，等.黃曲霉毒素的危害及其脫毒方法研究進展[J].動物醫學進展，2017，38（1）：89 ～ 93.

[7]孫玲玉，李超，郝海玉，等．泰山枯草芽孢桿菌的分離鑒定及其對黃曲霉毒素 B1的降解研究[J].中國畜牧獸醫，2014，41（8）：246 ～ 250.

[8]王偉，王世英，郭曉軍，等.β-葡聚糖酶產生菌的分離、篩選及鑒定[J].中國飼料，2014，5：17 ～ 20.

[9]Keller L A M，Keller K M，Monge M P，et al.Gliotoxin contam ination in pre-and postfermented corn，sorghum and wet brewer’s grains silage in Sao Paulo and Rio de Janeiro State，Brazil[J].Journal of Applied M icrobiology，2012，112（5）：865 ～ 873.

[10]Pereyra M L G，Alonso V A，Sager R，et al.Fungi and selected mycotoxins from pre-and postfermented corn silage[J].Journal of Applied M icrobiology，2008，104（4）：1034 ～ 1041.