奶牛溶菌酶在大腸桿菌中的分泌表達(dá)及抑菌活性研究

李云龍，張海濤，高　峰，顧開朗

（徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221006）

溶菌酶作為哺乳動物機(jī)體防御因子的重要成員，因?yàn)槠渚哂锌咕⑾住⒔M織修復(fù)以及提高免疫力等多方面活性，同時又是一種天然、無毒的蛋白質(zhì)，只作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，而對動物機(jī)體無害，如果能體外構(gòu)建溶菌酶的表達(dá)載體并高效表達(dá)，將具有深遠(yuǎn)的生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)價值。溶菌酶全稱1，4-β-N-溶菌酶，又稱黏肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，能夠特異水解細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1，4-糖苷鍵，是一種具有抗菌、溶菌活性的固有免疫效應(yīng)分子 （Prager等，1974）。目前已知在高等反芻動物（如牛、羊和鹿等）基因組中存在大概10種溶菌酶相似基因（Irwin等，1989）。然而研究發(fā)現(xiàn)，反芻動物雖然有眾多溶菌酶基因，但相對于其他動物機(jī)體缺乏溶菌酶（Prieur，1986）。此外，不同組織溶菌酶表達(dá)差異巨大，牛腎、血液、淚液、乳汁中溶菌酶表達(dá)水平低于大多數(shù)動物（Dobson等，1984），牛溶菌酶在乳腺中水平較低，僅為0.05～0.13mg/L，相比之下，人乳腺溶菌酶表達(dá)量可比其高2000～4000倍（Benkerroum，2008）。本研究選擇原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對奶牛乳腺溶菌酶基因進(jìn)行克隆表達(dá)，以期獲得高效表達(dá)的奶牛溶菌酶蛋白，并檢測其抑菌活性，為奶牛溶菌酶的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　材料

1.1載體構(gòu)建表達(dá)試驗(yàn)材料限制性內(nèi)切酶NcoI、XhoI購自 Fermentas 公司；T4 DNA Ligase，2×Taq Master Mix，PCR 產(chǎn)物回收試劑盒，膠回收試劑盒，DL 5000 bp Marker，中分子量蛋白 Marker，6×His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 （Ni-IDA），BCA蛋白濃度測定試劑盒購自ProbeGene公司；大腸桿菌TOP10菌株由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心保存；SDS，異丙基硫代半乳糖苷-誘導(dǎo)劑（IPTG）購自Amersco 公司；Acr、Bis、Tris購自 Sigma 公司，其他常規(guī)試劑從國藥集團(tuán)采購。

1.2抑菌試驗(yàn)材料雙抗儲存液（100×）制備：氨芐青霉素100萬單位，鏈霉素100萬單位，加重蒸水至100mL過濾除菌，用小瓶分裝，每瓶5mL，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ巳芫笜?biāo)品購自Merck公司，大腸桿菌BL21、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙門氏菌菌種為由揚(yáng)州大學(xué)動物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室提供。

2　方法

2.1LYZ基因cDNA鏈的合成根據(jù)已知的奶牛LYZ基因mRNA序列（NCBI Reference Sequence：NM_001077829.1）， 用 Primer Premier 6.0軟件將其翻譯為cDNA序列，并由上海生工公司合成。序列如下：CCATGGCTAAGAAATTTCAG CGTTGTGAGCTGGCGCGGACGCTGAAAAAGCTG GGGCTGGACGGCTACCGGGGCGTGAGTTTAGCA AACTGGGTTTGTCTGGCACGTTGGGAGAGTAAT TATAATACGAGAGCAACAAATTACAACCGTGGT GATAAAAGCACAGATTATGGTATTTTTCAGATC AATAGCCGTTGGTGGTGTAATGATGGGAAAACA CCGAAAGCAGTGAATGCATGTCGGATTCCGTGT AGCGCACTGCTGAAAGATGATATCACCCAGGCG GTTGCATGTGCGAAGCGCGTTGTGAGAGATCCC CAGGGGATTAAAGCATGGGTTGCATGGCGTAAC AAATGTCAAAATAGAGACCTGAGAAGCTACGTG CAGGGGTGTCGGGTTTAACTCGAG。其中CCAT GG為引入的NcoI酶切位點(diǎn)、CTCGAG為引入的XhoI酶切位點(diǎn)。

2.2酶切反應(yīng)采用雙酶切獲得目的片段，以下體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)2 h后，膠回收獲得載體片段和目標(biāo)片段。pET32T載體采用NcoI、XhoI雙酶切線性化后通過膠回收獲得載體片段。酶切反應(yīng)體系如下：

目的片段酶切體系50μL：目的片段1μg，10× FD Buffer 5 μL，NcoI 1 μL（10 U/μL），XhoI 1 μL （10 U/μL），加 ddH2O 至 50 μL。

載體的酶切體系50μL：載體1μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI 1 μL（10 U/μL），XhoI 1 μL（10 U/μL），加 ddH2O 至 50 μL。

2.3連接反應(yīng)將上述回收純化好的目的DNA片段和載體片段，進(jìn)行連接，按下述反應(yīng)體系22℃在PCR儀中連接反應(yīng)1 h。反應(yīng)體系如下：載體片段4μL，目的基因片段8μL，10×T4 DNAligase Buffer 2 μL，T4 DNAligase1 μL（400 U/μL），加ddH20至 20μL。

2.4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定挑選單菌落生長后用T7通用引物PCR擴(kuò)增篩選陽性克隆。T7通用引物：T7上游引物 5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，T7 下 游 引 物 5’ -TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。PCR擴(kuò)增條件：94℃5min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 個循環(huán)；72 ℃2min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測。挑選單菌落提取質(zhì)粒，采用NcoI、XhoI雙酶切驗(yàn)證條帶大小，反應(yīng)體系如下：載體1μg，10×FD Buffer 5 μL，NcoI 1 μL（10 U/μL），XhoI 1 μL（10 U/μL），加 ddH20至 50μL。37 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h。酶切產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠檢測。

2.5融合蛋白pET32T-LYZ的表達(dá)和分析挑取單克隆接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基 （含50mg/L氨芐），37℃培養(yǎng)約4 h，OD600為0.6左右，加入終濃度為0.6mM的IPTG誘導(dǎo)pET32T-LYZ的表達(dá)。37℃誘導(dǎo)2 h后收集菌體，處理后的菌體蛋白樣品進(jìn)行13%SDS-PAGE電泳。

2.6LYZ體外抑菌試驗(yàn)采用高壓流通蒸汽滅菌，在超凈工作臺中制備普通瓊脂培養(yǎng)基平板，待平板凝固，將液體培養(yǎng)的不同菌株均勻涂布于表面，利用同樣的滅菌的打孔器均勻打孔，將純化定量的LYZ、雙抗儲存液（陽性對照）、滅菌生理鹽水（空白對照）各取10μL加入不同培養(yǎng)板孔。放置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，測定各板的抑菌環(huán)并記錄。

3　結(jié)果與分析

3.1PCR篩選陽性克隆鑒定結(jié)果隨機(jī)挑選單菌落，用pET32T載體的T7通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1000bp位置處出現(xiàn)明亮條帶（圖1），與預(yù)期產(chǎn)物大小一致，表明克隆結(jié)果為陽性。

圖1　LYZ-pET32T菌落PCR鑒定

3.2重組陽性克隆酶切驗(yàn)證挑選單個菌落并提取質(zhì)粒，用NcoI、XhoI雙酶切驗(yàn)證條帶大小，如圖2。得到與理論值400bp相符的條帶，說明LYZ基因已成功克隆至pET32T載體中。

3.3表達(dá)及純化產(chǎn)物的鑒定SDS-PAGE電泳圖片顯示（圖3），在IPTG誘導(dǎo)后，出現(xiàn)一條約為33 kD的蛋白條帶，與理論分子量相當(dāng)，表明LYZ蛋白表達(dá)成功。

3.4LYZ抑菌活性檢測抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明（表1），純化的LYZ對大腸桿菌BL21、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌及沙門氏菌均形成抑菌環(huán)，表明LYZ對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長均有不同程度的抑制，并且抑菌環(huán)的大小和劑量相關(guān)。

圖2　LYZ-pET32T限制性酶切驗(yàn)證結(jié)果

圖3　表達(dá)及純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

表1　重組LYZ體外抗菌試驗(yàn)檢測結(jié)果

4　討論

溶菌酶在食品、工業(yè)和醫(yī)學(xué)中有巨大的應(yīng)用，在飼料生產(chǎn)與家畜飼養(yǎng)中，配合其他添加劑可以延長飼料的貯存期，同時又可以預(yù)防和治療動物消化道腹瀉等疾病。邢思華等（2012）研究表明，在基礎(chǔ)飼料中添加溶菌酶制對草魚生長性能和抗感染能力有顯著影響。目前，在臨床上主要使用抗生素來防治奶牛乳房炎，雖有一定的效果，但耐藥菌株日益增多，抗生素殘留問題始終得不到解決，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身心健康（Wright等，2005），有學(xué)者嘗試將具有較高活性的人溶菌酶基因轉(zhuǎn)入到奶牛（Yang 等，2011）和奶山羊（Maga 等，2006），使牛、羊乳腺分泌表達(dá)人溶菌酶，從而提高對乳房炎的抵抗力。楊睿等（2014）用不同來源的四種溶菌酶對引起奶牛乳房炎的葡萄球菌做抑菌試驗(yàn)，并從中篩選出抑菌效果最好的樣品。沈誠等（2011）構(gòu)建人的溶菌酶基因表達(dá)載體，將其注入患有乳房炎的奶牛的乳腺組織，用于治療奶牛乳房炎，治愈率高達(dá)97.4%。本研究對純化得到的奶牛溶菌酶進(jìn)行了抑菌性檢測，結(jié)果表明奶牛溶菌酶對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的生長均有不同程度的抑制作用，且隨著劑量的增加，抑菌效果也顯著增加，提示奶牛溶菌酶可以作為一種新型的藥物來預(yù)防和治療奶牛乳房炎，不僅能夠有效遏制濫用抗生素導(dǎo)致的一系列問題，而且不會對人產(chǎn)生免疫原性，對于動物抗病育種意義重大。但是奶牛溶菌酶對有益菌同樣也有抑菌效果，動物食用了含有溶菌酶的飼料后是否對腸道健康的微生態(tài)菌群有破壞作用，還需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)所獲得的重組奶牛溶菌酶是通過將溶菌酶基因轉(zhuǎn)化原核大腸桿菌并在體外純化收集得到的，其本質(zhì)屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，雖然張璐瑩等（2015）對牛乳溶菌酶的安全性進(jìn)行了評價，認(rèn)為重組牛乳溶菌酶制劑具有安全性，符合黏膜局部用藥標(biāo)準(zhǔn)，但長期使用這類藥物的安全性問題還需進(jìn)一步評估。

溶菌酶在真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)中表達(dá)的報道有很多。齊長學(xué)（2010）構(gòu)建酵母分泌型表達(dá)載體pPICZαA-LYZ1，并在受體菌 BL21（DE3）和 GS115中成功表達(dá)，章歡（2006）將牛溶菌酶基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，同樣獲得了良好的表達(dá)效果。有研究表明，溶菌酶對大腸桿菌有較強(qiáng)的殺菌作用，對宿主菌有一定毒性，致使溶菌酶在大腸桿菌中無法直接表達(dá)。從本試驗(yàn)的結(jié)果看，表達(dá)的蛋白以無活性的包涵體形式存在，很好地避免了上述問題，后續(xù)可以利用簡單的超聲裂解和離心方法即可獲得純化的重組蛋白，便于研究重組蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。

本研究在獲得目的基因CDS序列時，采用的是人工設(shè)計(jì)并合成的方法，這與付世新等（2010）所采用的方法一致，而王洪亮（2014）在獲得LYZ基因CDS序列時，采用了RT-PCR的方法，結(jié)果某些亞型溶菌酶基因由于表達(dá)量很低沒有克隆成功。本試驗(yàn)決定采用人工合成的方法獲得目的基因片段，主要原因有三點(diǎn)：一是目的片段堿基含量較少，用合成的方法可以大大降低成本；二是合成的片段是高保真的，不會因?yàn)椴蓸訒r個人的差異造成堿基的突變；三是可以在合成的片段上加以修飾，增加一些酶切位點(diǎn)，方便后續(xù)的連接反應(yīng)。

5　結(jié)論

本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)載體LYZ-pET32T，通過誘導(dǎo)獲得了高效表達(dá)的奶牛溶菌酶蛋白，并檢測了其抗菌性，為進(jìn)一步推廣奶牛溶菌酶的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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