宮頸癌患者三維能量多普勒超聲下血流情況與HPV分型的相關(guān)性研究

孫海婷，王瑩瑩，項(xiàng)小苗，陸敏莉

血管生成是宮頸癌的浸潤(rùn)、生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因之一。關(guān)于宮頸癌血管生成及如何對(duì)其抑制是治療宮頸癌的重要出路，因此一直是研究的熱點(diǎn)。超聲是目前無創(chuàng)評(píng)估血流的常用方法，具有便宜、快捷、易操作和可重復(fù)多次實(shí)施等特點(diǎn)；三維能量多普勒（3D-CPA）屬于定量分析方法，可準(zhǔn)確分析和計(jì)算宮頸內(nèi)血流的分布，是既無創(chuàng)且可靠的新方法之一。本研究采用3D-CPA技術(shù)檢測(cè)血管指數(shù)（VI）和血管分級(jí)[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，隨著高危型人類乳頭瘤病毒（HRHPV）負(fù)荷量增加，宮頸高度上皮內(nèi)瘤變（CIN）和宮頸癌的發(fā)生率明顯高于負(fù)荷量低的HR-HPV患者[2]。研究發(fā)現(xiàn)HPV E6促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的過度表達(dá)，從而促進(jìn)宮頸癌的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)[3]。VEGF是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤血管形成有關(guān)的最強(qiáng)的促腫瘤血管生成的分子之一，也與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)[4]。VEGF一直被認(rèn)為與血管生成相關(guān)，HPV E6可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，高危型HPV是否也通過相同的通路刺激血管的生成？本文旨在對(duì)此問題進(jìn)行研究，為今后宮頸癌的診療提供依據(jù)。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 選擇寧波市象山縣第一人民醫(yī)院2015年6月至2017年6月于本院住院的宮頸癌患者98例，采用原位 PCR雜交和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HPV16/18感染，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將病例分為 4組，僅 HPV16陽性為 32例為HPV16組；僅 HPV18陽性為25例為HPV18組；HPV16和18均陽性18例為HPV16+18組；兩者皆陰性、且低危型HPV陽性為對(duì)照組共23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)陰道鏡取材活檢證實(shí)為宮頸癌患者、未接受放療及化療等干預(yù)、3D-CAP檢查后1個(gè)月內(nèi)接受手術(shù)切除術(shù)；排除標(biāo)準(zhǔn)：患者正參與另外一項(xiàng)藥物或醫(yī)療器械臨床試驗(yàn)、不能配合檢查的神經(jīng)障礙或其他嚴(yán)重疾病患者、具有任何需要急救的緊急醫(yī)療狀況。各組宮頸癌國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）[5]臨床分期及病理類型的構(gòu)成比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＞0.05），見表 1。

1.23D-CPA檢測(cè) 對(duì)各組研究對(duì)象行經(jīng)陰道宮頸三維超聲（PHILIPS iu22超聲診斷儀）成像，采用QLAB軟件分析宮頸的體積。啟動(dòng)能量多普勒（CPA）檢測(cè)技術(shù)，對(duì)宮頸的血管進(jìn)行三維成像，檢測(cè)過程中對(duì)宮頸進(jìn)行動(dòng)態(tài)旋轉(zhuǎn)，已達(dá)到充分顯示血管分支和立體走行的效果。參考文獻(xiàn)[6]對(duì)三維成像顯示出的宮頸血管進(jìn)行分級(jí)，其中0級(jí)：宮頸周邊及內(nèi)部未見血流信號(hào)；I級(jí)：宮頸周邊可見短條狀或點(diǎn)狀分布的血管，宮頸內(nèi)未見無血管分布；Ⅱ級(jí)：除宮頸周圍可見血管，宮頸內(nèi)部也可存在稀疏的血管分布，走行較平直分支簡(jiǎn)單；Ⅲ級(jí)：子宮頸內(nèi)可見密集的血管網(wǎng)和/或血管樹，走行扭曲、分支復(fù)雜且不規(guī)則。軟件計(jì)數(shù)宮頸中的血管總數(shù)以及其與宮頸體積的比值即單位宮頸體積的血管條數(shù)，此比值為血管指數(shù)（VI），它可體現(xiàn)宮頸血供情況。血管數(shù)量由3位有經(jīng)驗(yàn)的超聲科醫(yī)生分別計(jì)數(shù)3次，取平均值作為最終值。

1.3免疫組化染色 手術(shù)切除術(shù)后選取各組研究對(duì)象的宮頸部位的組織切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶（S-P）免疫組化法染色。一抗為鼠抗人VEGF單克隆抗體和CD34單克隆抗體，操作按照抗體說明書操作。

1.4微血管密度（MVD）的計(jì)數(shù)CD34可標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，呈棕黃色染色為陽性。癌細(xì)胞的間質(zhì)內(nèi)存在孤立的棕黃色血管腔面積小于8個(gè)紅細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇，且無肌層管壁者為1條獨(dú)立的微血管。病理醫(yī)生在低倍鏡下（×200）（Olympus生物顯微鏡）下檢查微血管的染色情況，取3個(gè)癌巢最多間質(zhì)血管視野作為血管熱點(diǎn)區(qū)，高倍視野下（×400）計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的MVD，平均值記為該例腫瘤的MVD值。

1.5VEGF陽性判定 VEGF主要位于細(xì)胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒定義為陽性細(xì)胞。選擇5個(gè)高倍視野下計(jì)數(shù)腫瘤總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，陽性細(xì)胞/腫瘤總細(xì)胞數(shù)得出陽性細(xì)胞百分率，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；無特異性染色為0分，染色強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者積分相乘，0～1分為陰性（－），2～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（2+），9～12分為強(qiáng)陽性（3+）。

1.6HPV檢測(cè) 采用深圳亞能生物技術(shù)公司提供的 PCR-反向點(diǎn)雜交法能夠檢測(cè)5種低危亞型（HPV6、11、42、43、44）和 18種高危亞型（HPV16、18、33、35、31、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、84、MM4），此檢測(cè)法可檢出HPV的最小拷貝數(shù)為1.0×103copies/ml，結(jié)果按芯片上相應(yīng)著色位點(diǎn)分布判讀出HPV亞型。

1.7觀察指標(biāo) 3D-CPA檢測(cè)下的血管分級(jí)及病理下的MVD、VI及VEGF陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組內(nèi)比較采用檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用LSD-檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.14組VEGF表達(dá)比較 4組VEGF陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=13.82，＜0.05），其中對(duì)照組明顯低于HPV16組、HPV18組及HPV16+18組（2=4.02、5.60、13.24 均＜0.05）。見表2。

表1　各組臨床分期及病理類型的構(gòu)成比比較 例

2.2血管分級(jí)下 HPV感染亞型比例趨勢(shì)分析 所有病例無0級(jí)血流，對(duì)照組I級(jí)比例明顯高于 HPV陽性各組（2=10.29、10.50、6.71，均＜ 0.05）。對(duì)照組III級(jí)比例明顯低于HPV陽性各組（2=6.15、6.27、2.51，均＜ 0.05），II級(jí)血流比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=1.04、0.64、0.24，均＞0.05）。見表3。

2.34組 MVD值及 VI值比較 4組MVD值和 VI值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.05），其中對(duì)照MVD值和VI值明顯低于 HPV16組、HPV18組和HPV16+18組（均＜0.05）。見表4。

3　討論

高危型HPV16/18感染一直被認(rèn)為與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)，其與宮頸癌腫瘤MVD及三維超聲下VI的關(guān)系的研究報(bào)道較少。有人在研究胡蘿卜素對(duì)血管形成的作用中同時(shí)發(fā)現(xiàn)，用帶HPV16/18基因組的宮頸癌細(xì)胞株Skvt和Hela注入裸鼠皮下，腫瘤血管形成的能力明顯高于HPV16/18基因的細(xì)胞株細(xì)胞[7]。在研究14-HPV16轉(zhuǎn)基因小鼠的過程中發(fā)現(xiàn)，微血管計(jì)數(shù)、VEGF mRNA（VEGFmRNA）表達(dá)量與 E6/E7mRNA的表達(dá)量呈正相關(guān)，因此推測(cè)HPV16/18病毒感染可以上調(diào)VEGF，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[8]。國內(nèi)研究結(jié)果顯示，在原位癌和浸潤(rùn)癌中，HPV16/18感染率增加與 MVD間無明顯相關(guān)，提示高危型HPV16/18病毒在宮頸癌的微血管的生成可能并非起直接作用[9]。本研究其中一部分重復(fù)了類似的試驗(yàn)，且結(jié)果顯示高危型HPV16/18感染的宮頸癌患者，MVD與VEGF表達(dá)水平均明顯高于低危型感染者，與過去研究結(jié)果有差異，具體原因需要進(jìn)一步從信號(hào)通路上進(jìn)行探討。

研究證實(shí)，CIN發(fā)展成宮頸浸潤(rùn)癌的過程中，均存在不同程度血管生成，隨著病變惡化，病變中的MVD及多種血管生成誘導(dǎo)因子如 VEGF表達(dá)顯著增加，后者表達(dá)水平與預(yù)后密切相關(guān)[7,10]。3D-CPA將多普勒信號(hào)與空間定位相結(jié)合，從三維方式的角度立體呈現(xiàn)臟器及病灶內(nèi)處的血流分布。三維能量多普勒定量分析法為分析和準(zhǔn)確計(jì)算宮頸病灶內(nèi)外的血流分布提供了一個(gè)無創(chuàng)的新方法。VI是宮頸單位體積內(nèi)的血管數(shù)量，可直觀呈現(xiàn)腫瘤血供情況的重要指數(shù)。區(qū)域VI值越高，代表區(qū)域的新生血管越密集[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌、CIN及正常患者的宮頸VI值存在顯著差異，VI用于診斷宮頸癌的AUC為0.848，可見VI不僅僅是體評(píng)估腫瘤血管新生的好工具，同時(shí)也是良惡性判斷的有效指標(biāo)[13]。本研究嘗試使用3D-CPA對(duì)研究對(duì)象的病灶血流進(jìn)行分析結(jié)合病理指標(biāo)MVD和VI，結(jié)果顯示3D-CPA所得血管分級(jí)結(jié)果為非HPV感染病例（對(duì)照組）血管分級(jí)I的比例明顯高于HPV陽性各組，而分級(jí)III比例明顯低于各組；于此對(duì)應(yīng)的病理結(jié)果顯示對(duì)照組的MVD值與VI值均不同程度的低于HPV陽性各組。

表2　各組VEGF表達(dá)比較

表3　血管分級(jí)下HPV感染亞型比例趨勢(shì)分析 例（%）

表4　各組MVD值及VI值比較

本研究還提示高危型患者VEGF表達(dá)水平高，可能是血流旺盛的主要原因之一。綜上所述，HPV16/18宮頸癌患者病變血流更為豐富，可能與預(yù)后有著密切關(guān)系，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Liang H,Fu M,Zhou J,et al.Evaluation of 3D-CPA,HR-HPV,and TCT joint detection on cervical disease screening[J].Oncology Letters,2016,12(2):887-892.

[2] Song SH,Lee JK,Seok OS,et al.The relationship between cytokinesand HPV-16,HPV-16 E6,E7,and high-risk HPV viral load in theuterine cervix[J].Gynecologic Oncology,2007,104(3):732-738.

[3] Goncharuk IV,Vorobjova LI,Lukyanova NY,et al.Vascular endothelial growth factor exressioninuterinecervical cancer:correlation with clinicopathologic characteristics and survival[J].Experimental Oncology,2009,31(3):179.

[4]Mitsuhashi A,Suzuka K,Yamazawa K,et al.Serumvascular endothelial growthfactor(VEGF)and VEGF-C levels as tumor markers in patients with cervical carcinoma[J].Cancer,2010,103(4):724-730.

[5]Benedet JL,Bender H,Rd JH,etal.FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers.FIGOCommitteeon Gynecologic Oncology[J].International Journal of Gynaecology&Obstetrics the Official Organ of the International Federation of Gynaecology&Obstetrics,2000,70(2):209.

[6] Raza S,Baum JK.Solid breast lesions:Evaluation with power Doppler US[J].Radiology,1997,203(1):164-168.

[7]Szmurlo A,Marczak M,Rudnicka L,et al.Beta-carotene in prevention of cut aneous carcinogenesis[J].Actadermato-venereologica,1991,71(6):528-30.

[8]Smith-Mccune K,Zhu Y H,Hanahan D,etal.Cross-speciescomparisonof angiogenesis during the premalignant stages of squamous carcinogenesis in the human cervix and K14-HPV16transgenic mice[J].Cancer Research,1997,57(7):1294.

[9] 陳利友,姚濟(jì)芬,石一復(fù).子宮頸癌HPV 16/18感染與微血管密度和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的關(guān)系[J].浙江醫(yī)學(xué),2006,28(7):519-522.

[10]Fujimoto J,Toyoki H,Sato E,et al.Clinical implication of expression of vascular endothelial growth factor-C in metastatic lymph nodesof uterinecervical cancers[J].British Journal of Cancer,2004,91(3):466-469.

[11]Liang H,Fu M,Zhou J,et al.Evaluation of 3D-CPA,HR-HPV,and TCT joint detection on cervical disease screening[J].Oncology Letters,2016,12(2):887-892.

[12]Hui L,Min F,Fumin L,etal.Transvaginal three-dimensional color power Doppler ultrasound and cervical MVD measurement in the detection of cervical intraepithelial neoplasia[J].European Review for Medical&Pharmacological Sciences,2014,18(14):1979-84.

[13]李平,王學(xué)梅,張雨芹,等.三維能量多普勒超聲檢測(cè)宮頸癌血流的價(jià)值[J].中國超聲醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(11):1066-1068.