不同生育期轉(zhuǎn)Bt基因棉根系分泌物中氨基酸、有機(jī)酸等組分特征

趙悅 席瑞澤 付慶靈 朱俊 胡紅青

摘要：通過(guò)水培抗蟲(chóng)棉及其親本棉，研究不同生育期（幼苗期、苗期和花蕾期）棉花根系分泌的有機(jī)酸、氨基酸及Bt蛋白等分泌組成特征。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt基因棉和常規(guī)棉根系分泌物的pH隨生育期逐漸降低，由幼苗期的堿性（>8.0）轉(zhuǎn)變?yōu)榛ɡ倨诘娜跛嵝裕?6.8）；根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮、Bt蛋白、有機(jī)酸、氨基酸及可溶性總糖隨著生育期的延長(zhǎng)顯著上升。相同生育時(shí)期，兩種棉花根系分泌物主要組成成分無(wú)差異，但是大多數(shù)組分（如水溶性碳、水溶性氮、可溶性總糖、氨基酸、有機(jī)酸等）的含量表現(xiàn)為常規(guī)棉>轉(zhuǎn)Bt基因棉，且花蕾期差異最顯著。甲酸為根系分泌物中有機(jī)酸的主要成分，在幼苗期、苗期和花蕾期，轉(zhuǎn)Bt基因棉根分泌物中甲酸分別占有機(jī)酸含量的55%、75%、93%；常規(guī)棉根系分泌物中甲酸分別占有機(jī)酸含量的65%、39%、96%，因此，轉(zhuǎn)Bt基因棉和常規(guī)棉甲酸含量差異是引起有機(jī)酸差異的主要原因。蘇氨酸是根系分泌物中氨基酸的主要成分，在花蕾期，轉(zhuǎn)Bt基因棉和常規(guī)棉根系分泌物中蘇氨酸含量分別占總氨基酸的42%和36%。與轉(zhuǎn)Bt基因棉相比，常規(guī)棉根系分泌物中含有更為豐富的碳、氮源物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)Bt基因棉；根系分泌物；Bt蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）04-0026-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.007

Component Characteristics of Amino Acids and Organic Acids in Root Exudates from Transgenic Bt Cotton at Different Growth Stages

ZHAO Yue1，2，XI Rui-ze1，F(xiàn)U Qing-ling1，ZHU Jun1，HU Hong-qing1

（1.College of Resource and Environment，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；

2.CNSG Anhui Hong Sifang Co.，Ltd.，Hefei 230022，China）

Abstract： The component characteristics including organic acids， amino acids and Bt proteins of root exudates at different growth stages （seedling， seedling stage and bud stage） from transgenic Bt cotton and conventional cotton were studied. The results showed that the pH of transgenic Bt cotton and common cotton root exudates decreases gradually in the growth period， from the alkaline in seedling stage （>8.0） to the subacidity of the bud stage （<6.8）； The water-soluble carbon，water-soluble nitrogen， Bt proteins， organic acids， amino acids and total soluble sugar were increased significantly with the extension of growth period. At the same growth stages， there were no difference in main components of the two cotton root exudates， but the most root exudates component of conventional cotton（such as the water-soluble carbon， water-soluble nitrogen， total soluble sugars， amino acids， organic acids， etc.） were higher than those in Bt cotton， especially in the bud stage. As the main organic acid in the root exudates， formic acid in transgenic Bt cotton root exudates accounted for 55%， 75% and 93% at the young seedling， seedling and bud stages， respectively， and that in conventional cotton root exudates accounted for 65%， 39% and 96%， respectively. Therefore， the content of the formic acids was the main difference in the organic acids between the conventional and transgenic Bt cottons. As one of main amino acids in root exudates， threonine in the transgenic Bt cotton and conventional cotton at the bud stage accounted for 42% and 36%， respectively. Compared to the transgenic Bt cotton， the conventional cotton root exudates could provide more carbon and nitrogen resources for plant growth.

Key words： transgenic Bt cotton； root exudates； Bt proteins

大面積種植轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉（又稱(chēng)轉(zhuǎn)Bt基因棉、轉(zhuǎn)Bt棉），在一定程度上降低了農(nóng)藥的使用，提高了棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]，增加了經(jīng)濟(jì)效益。付慶靈等[2]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt基因棉可釋放Bt蛋白到土壤根際，推測(cè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)棉根系分泌物中也可能存在Bt蛋白。李孝剛等[3]發(fā)現(xiàn)，由于外源基因的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉及常規(guī)棉之間根系分泌的氨基酸和糖類(lèi)組成及含量存在顯著差異，但未對(duì)根系分泌有機(jī)酸加以研究。馮潔等[4]分析檢測(cè)了棉花根系分泌物中不同品種的氨基酸含量，差異最大的是丙氨酸，其余無(wú)顯著性差異。根系分泌物以養(yǎng)分的形式進(jìn)入土壤，加快了植物與土壤進(jìn)行物質(zhì)、能量與信息的交流[5]。因此，探明根系分泌物的特征有助于理解根際微生物相互作用機(jī)理。

本試驗(yàn)在無(wú)菌條件下收集轉(zhuǎn)Bt基因棉及其親本常規(guī)棉根系分泌物，鑒定其組成，對(duì)比轉(zhuǎn)Bt基因棉和常規(guī)棉根分泌物成分的差異，為將來(lái)探索轉(zhuǎn)Bt基因棉根系分泌物對(duì)土壤理化性質(zhì)、酶活性和土壤微生物的多樣性的影響提供依據(jù)[6]，為研究轉(zhuǎn)Bt基因棉根分泌對(duì)生態(tài)環(huán)境安全問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水培試驗(yàn)

轉(zhuǎn)Bt基因棉及其親本常規(guī)棉種子均由湖北省種子集團(tuán)有限公司提供。將轉(zhuǎn)Bt基因棉種及其親本常規(guī)棉放入36 ℃烘箱（烘2 d）破除種子休眠，然后將種子在濃度為75%乙醇中處理30 s消毒，再用去離子水沖洗干凈，將種子放入60 ℃溫水中浸泡6～7 h后催芽處理（下層墊厚1 cm左右海綿，鋪紗布-鋪種子-蓋紗布，紗布保持潤(rùn)濕即可）。待棉花芽長(zhǎng)至3 cm時(shí)，用夾子將單層紗布固定在盒子周邊，加滿水，紗布上鉆上小洞，將棉種芽放入洞中，使其進(jìn)入液面吸水。當(dāng)棉花三葉一心時(shí)，小心將作物幼苗取出，將根部沖洗干凈，開(kāi)始進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)。取出生長(zhǎng)一致棉花幼苗移栽于盛滿營(yíng)養(yǎng)液的塑料水培箱（38 cm×56 cm×7 cm），溫室里培養(yǎng)（光照14 h（6：00-20：00），溫度為25～30 ℃），每隔7 d換一次營(yíng)養(yǎng)液。營(yíng)養(yǎng)液配方采用H.C.阿夫多寧水培配方[7]，含0.240 g/L NH4NO3、0.100 g/L Na2HPO4·12H2O、0.100 g/L NaH2PO4·H2O、0.360 g/L CaC12·2H2O、0.500 g/L MgSO4·7H2O和0.025 g/L Fe-EDTA，以及阿農(nóng)營(yíng)養(yǎng)液的微量元素。

1.2 作物根系分泌物的收集

在棉花幼苗期（19 d）、苗期（63 d）、花蕾期（138 d）收集根系分泌物，取20株大小一致的棉苗為一組，先用去離子水小心沖洗根部，然后放入加有400 mL去離子水的塑料燒杯內(nèi)，根部遮光，每天收集5 h（10：00-15：00），收集液及時(shí)過(guò)濾帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存。將上述棉苗放回培養(yǎng)盒中。間隔1 d后繼續(xù)如上條件收集，連續(xù)收集3次；合并收集液，于冷凍干燥機(jī)中濃縮至原體積的1/20，濃縮后0.4 mL濃縮液含1株棉花5 h的分泌量。將其收集在無(wú)菌的密閉容器中，-20 ℃保存，待測(cè)定分析。

1.3 根系分泌物的分析方法與數(shù)據(jù)處理

根系分泌物的基本性質(zhì)采用土壤農(nóng)化常規(guī)分析方法測(cè)定[8]，根系分泌物pH采用pH計(jì)測(cè)定；可溶性總糖采用蒽酮比色法測(cè)定；根分泌物Bt蛋白含量用ELISA法測(cè)定，所用酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海佑隆生物科技有限公司，ELISA檢測(cè)根分泌物中的CrylAb、CrylAc晶體蛋白含量。操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

有機(jī)酸的測(cè)定是將濃縮的根系分泌物分別過(guò)陽(yáng)離子和陰離子樹(shù)脂，最后用8 mL 2 mol/L HCl的交換陰離子樹(shù)脂中吸收的有機(jī)陰離子。將HCl洗液冷凍濃縮凍干，并用1.5 mL去離子水溶解，過(guò)0.45 μm的濾膜后用HPLC（Agilent 1200，美國(guó)）測(cè)定有機(jī)酸含量。色譜柱為ZORBAX SB-Aq，（4.6 mm×150 mm，5 μm，美國(guó)），流動(dòng)相為25 mmol/L磷酸二氫鉀（pH 2.5）和甲醇（色譜純）（V/V=98∶2）；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL；流速為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。樣品中有機(jī)酸的定量分析采用外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）按峰面積計(jì)算。

氨基酸的測(cè)定采用L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀（日本日立公司），氨基酸專(zhuān)用分析色譜柱46 mm×60 mm；檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm和570 nm；柱溫35 ℃；流速0.400 mL/min；柱后衍生試機(jī)流速0.350 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。待測(cè)氨基酸有16種，分別是天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、精氨酸。

用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步整理，SPSS 17.0軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行方差分析和回歸分析。數(shù)據(jù)作圖采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育時(shí)期棉花根系分泌物pH的變化

從幼苗期到花蕾期，兩種棉花根系分泌物的pH均由堿性向弱酸性轉(zhuǎn)化（圖1），這可能是由棉花根際分泌物的H+及有機(jī)酸等物質(zhì)的增加引起的。相同生育時(shí)期，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉pH無(wú)顯著性差異。

2.2 不同生育期棉花根系分泌物中Bt蛋白含量的變化

如圖2所示，轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物幼苗期和苗期的Bt蛋白含量分別為30.1、28.7 ng/株，二者未達(dá)到顯著性差異。常規(guī)棉根系分泌物幼苗期和苗期的Bt蛋白含量分別為24.5、21.0 ng/株，二者也未達(dá)到顯著性差異。而在花蕾期，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中Bt蛋白分別為64.9、45.4 ng/株，與幼苗期、苗期Bt蛋白含量相比達(dá)到顯著性差異，即本研究的3個(gè)生育時(shí)期，花蕾期根部分泌的Bt蛋白最多。比較相同生育期轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根分泌Bt蛋白的含量，在幼苗期、苗期和花蕾期轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中Bt蛋白含量均大于常規(guī)棉，且達(dá)到顯著性水平。

2.3 不同生育時(shí)期根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮、水溶性碳氮比和可溶性總糖的變化

由圖3可知，棉花根系分泌物中的水溶性碳含量隨生育期的延長(zhǎng)，均呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。各生育期，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉水溶性碳均有顯著性差異，轉(zhuǎn)Bt棉花蕾期的水溶性碳分別是幼苗期和苗期的8～43倍，常規(guī)棉花蕾期的水溶性碳分別是幼苗期和苗期的8～18倍。由此可知，花蕾期棉花根部將分泌大量的水溶性碳。

在根系分泌物中，幼苗期轉(zhuǎn)Bt棉與常規(guī)棉水溶性碳含量無(wú)顯著性差異，分別為0.27、0.28 mg/株；苗期轉(zhuǎn)Bt棉水溶性碳含量為0.65 mg/株，常規(guī)棉水溶性碳含量為1.47 mg/株，差異達(dá)到顯著水平；花蕾期常規(guī)棉水溶性碳含量為轉(zhuǎn)Bt棉的2.4倍。可知，常規(guī)棉花蕾期根分泌水溶性碳遠(yuǎn)高于轉(zhuǎn)Bt棉。

由圖4可知，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中可溶性氮隨生育期的延長(zhǎng)呈遞增的趨勢(shì)，且各時(shí)期可溶性氮的含量呈顯著性差異。特別是花蕾期，轉(zhuǎn)Bt棉可溶性氮的含量分別是幼苗期和苗期的19倍和6倍；常規(guī)棉可溶性氮的含量分別是幼苗期和苗期的16倍和7倍?？芍?，隨生育期的延長(zhǎng)，根部可溶性氮的分泌也顯著增加。在各個(gè)時(shí)期，常規(guī)棉根系分泌物中可溶性氮的含量大于轉(zhuǎn)Bt棉，且呈顯著差異。

圖5為不同生育時(shí)期轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中水溶性碳氮比的變化。各生育時(shí)期，轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中水溶性碳氮比在3～5，苗期的水溶性碳氮比最低。常規(guī)棉根系分泌物中水溶性碳氮比隨生育期的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，且各生育期均達(dá)到顯著性水平。比較常規(guī)棉和轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中水溶性碳氮比，在幼苗期，轉(zhuǎn)Bt棉是常規(guī)棉的1.9倍，出現(xiàn)此變化主要原因可能是常規(guī)棉幼苗期水溶性碳的含量低引起的；苗期和花蕾期常規(guī)棉根系分泌物中水溶性碳氮比均大于轉(zhuǎn)Bt棉。

由圖6可知，從幼苗期到花蕾期，兩種棉花根系分泌物中可溶性總糖呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，且花蕾期遠(yuǎn)高于幼苗期和苗期。相同生育時(shí)期，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉在幼苗期可溶性總糖均較低，二者間差異不顯著；在苗期和花蕾期，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中可溶性總糖含量均達(dá)到顯著差異，常規(guī)棉在苗期和花蕾期根系分泌物中可溶性總糖分別是轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中的1.9、1.6倍。由此可知，與轉(zhuǎn)Bt棉相比，常規(guī)棉可通過(guò)根部分泌更多的可溶性總糖。

2.4 不同生育時(shí)期根系分泌物中有機(jī)酸含量的變化

由表1可知，在3個(gè)不同的生育期，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中檢測(cè)到7種有機(jī)酸。在幼苗期和苗期，常規(guī)棉根系分泌物中有機(jī)酸總量均高于轉(zhuǎn)Bt棉；在花蕾期，兩種棉花根系分泌物中有機(jī)酸含量迅速增加，主要是由花蕾期甲酸含量的增加引起的。在幼苗期、苗期和花蕾期轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中甲酸分別占有機(jī)酸總量的55%、75%、93%，而常規(guī)棉根系分泌物中甲酸分別占有機(jī)酸總量的65%、39%、96%。

在每個(gè)時(shí)期兩種棉花根系分泌物中均含有草酸和甲酸。其中，甲酸是有機(jī)酸的主要成分，而乙酸只有在幼苗期轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中和常規(guī)棉苗期根分泌物中檢測(cè)到。蘋(píng)果酸和琥珀酸均在花蕾期根系分泌物中檢測(cè)到，而酒石酸只在苗期根系分泌物中檢測(cè)到。由此可知，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物在不同的時(shí)期分泌的有機(jī)酸種類(lèi)和含量均有較大的差異。

2.5 不同生育時(shí)期根系分泌物中氨基酸含量的變化

由表2可知，隨著生育期的延長(zhǎng)，氨基酸總量也隨之增加，且每個(gè)時(shí)期中，常規(guī)棉根分泌物氨基酸的總量始終高于轉(zhuǎn)Bt棉。共檢測(cè)到16種氨基酸，蘇氨酸是根系分泌物中氨基酸的主要成分，在幼苗期、苗期和花蕾期轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中蘇氨酸分別占氨基酸總量的0.7%、26.0%、42.0%，而常規(guī)棉根系分泌物中蘇氨酸分別占氨基酸總量的0.7%、18.0%、36.0%。在Bt幼苗期根系分泌物中未檢測(cè)到半胱氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，而在苗期和花蕾期均檢測(cè)到了這5種氨基酸，可知隨著棉花生育期的增長(zhǎng)，根部分泌的氨基酸種類(lèi)也隨之增加。由此可知，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物在不同的時(shí)期分泌的氨基酸種類(lèi)和含量均有較大的差異。

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中的各組分（可溶性碳、可溶性氮、可溶性糖、Bt蛋白、氨基酸、有機(jī)酸等）的含量均有較大的差異。常規(guī)棉各生育期根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮含量均高于轉(zhuǎn)Bt棉。Grayston等[9]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物改變了其根系分泌物和化學(xué)成分，遺傳改良可能影響到植物分解速率和碳、氮含量，從而改變土壤環(huán)境[10]。與轉(zhuǎn)Bt棉相比，常規(guī)棉根系分泌更多的碳、氮源物質(zhì)。

棉花的各生育期內(nèi)，轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中可溶性總糖含量均小于常規(guī)棉。已有研究發(fā)現(xiàn)抗病棉花根系分泌物中糖類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)差異較小，但常規(guī)棉根系分泌物中的各種可溶性糖含量均顯著大于轉(zhuǎn)Bt棉[11-14]。Wu等[15]、韓雪等[16]研究發(fā)現(xiàn)，作物的抗病性能隨根系分泌物中的可溶性糖含量的下降而增加。可見(jiàn)，作物有抗病蟲(chóng)功能時(shí)會(huì)抑制作物根系可溶性糖的分泌。

大量研究證實(shí)，轉(zhuǎn)Bt基因植物可通過(guò)植株殘留和根系分泌釋放Bt蛋白進(jìn)入土壤。Saxena等[17]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)Bt玉米能通過(guò)根部滲出物釋放Bt蛋白進(jìn)入周?chē)寥?，且保持了很?qiáng)的殺蟲(chóng)活性。轉(zhuǎn)Bt基因水稻可利用根系向土壤中釋放Bt蛋白[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，從幼苗期到花蕾期，轉(zhuǎn)Bt基因棉和常規(guī)棉根系分泌物中均可檢測(cè)到Bt蛋白的存在，但是轉(zhuǎn)Bt棉的Bt蛋白顯著高于常規(guī)棉，且在花蕾期Bt蛋白含量最高。

轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中存在種類(lèi)豐富的有機(jī)酸和氨基酸物質(zhì)。在相同生育時(shí)期，各有機(jī)酸的含量有較大差異，而主要成分沒(méi)有差異。其中根系分泌物中有機(jī)酸主要有草酸、甲酸、乙酸、酒石酸、蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸，甲酸為主要有機(jī)酸，與Li等[19]的研究結(jié)果吻合。

本試驗(yàn)棉花根系分泌物中共檢測(cè)到16種氨基酸，與前人的研究結(jié)果相近[20]。表明轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物中氨基酸含量多數(shù)會(huì)隨著生育期的延長(zhǎng)而增加，其中蘇氨酸和丙氨酸是氨基酸的主要成分，常規(guī)棉根系分泌物中氨基酸的含量明顯高于轉(zhuǎn)Bt棉，且差異明顯。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt棉和親本常規(guī)棉根系分泌物中氨基酸含量存在顯著性差異，與本研究結(jié)論一致。也有研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)棉根系分泌物中游離氨基酸的含量和種類(lèi)都大于轉(zhuǎn)Bt棉[13，14]。

根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮、可溶性總糖、有機(jī)酸、氨基酸、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮在3個(gè)生育時(shí)期均呈現(xiàn)遞增的變化趨勢(shì)，且同一生育時(shí)期常規(guī)棉根系分泌物中各組分的含量均大于轉(zhuǎn)Bt棉，而轉(zhuǎn)Bt棉根系分泌物中Bt蛋白大于常規(guī)棉。這可能是外源Bt基因?qū)牒笠鸶捣置谖锘瘜W(xué)組成的改變[22]。轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)棉由于外源基因的插入，引起受體棉花同工酶譜[23]和揮發(fā)性氣味的化學(xué)成分改變，閻鳳鳴等[24]、Grayston等[9]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物改變了其根系分泌物和化學(xué)成分及其植物分解速率，遺傳改良可能影響到植物分解速率和碳、氮水平，這些因素都可能是引起轉(zhuǎn)Bt棉和常規(guī)棉根系分泌物差異的原因。

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