上皮性卵巢癌中化療耐藥相關蛋白標志物的表達及意義分析

楊麗華，屈莉紅安丘市人民醫院婦科，山東 濰坊6 山東省海陽市人民醫院婦產科，山東 煙臺651

卵巢癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，在中國其發病率僅次于乳腺癌和宮頸癌，居第3位[1]。由于宮頸癌位于盆腔深部，早期癥狀容易被忽略，故多數患者確診時已處于晚期甚至終末期，病死率較高。傳統的治療方案對腫瘤細胞和健康細胞無差別殺傷，造成一系列的不良反應。20世紀90年代，紫杉醇類藥物聯合鉑類藥物的化療方案應用于卵巢惡性腫瘤患者，提高了短期治療效果，但是總體來看，未能明顯增加卵巢癌患者的5年生存率[2‐3]。化療耐藥性是影響治療效果和預后效果的首要因素。化療耐藥機制是一個復雜的過程，是多個基因、多個水平和多個因素共同調控的結果。本研究通過免疫組化SP法檢測腫瘤蛋白P53、凋亡抑制蛋白livin、谷胱甘肽S轉移酶‐π（glu‐tathione S‐transferase‐π，GST‐π）和Ⅱ型DNA拓撲異構酶（DNA topoisomeraseⅡ，DNA TopoⅡ）等化療耐藥相關蛋白在上皮性卵巢癌中的表達情況，分析其與上皮性卵巢癌的治療效果及預后的關系，為靶向治療和個體化用藥方案提供參考依據，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2011年1月至2012年1月安丘市人民醫院婦產科經手術、病理學檢查確診的82例上皮性卵巢癌患者，取其上皮性癌變組織為研究對象，所有組織于離體15 min內制成標本，取材后經甲醛完全浸泡，常規石蠟包埋，切片備用。納入標準：①所有病例經病理學檢查，確診為上皮性卵巢癌，有完整的臨床病理資料并完成所有的術后隨訪；②術前均未接受化療、放療和免疫治療。排除標準：①合并其他腫瘤；②患者依從性差。入選的82例患者全部為女性，年齡為25～75歲，平均為（56.28±6.23）歲，其中＞50歲者有63例，≤50歲者有19例。所有患者根據美國腫瘤綜合協作網（Na‐tionalComprehensiveCancerNetwork，NCCN）《2009年卵巢癌臨床實踐指南》分為Ⅰ～Ⅱ期22例和Ⅲ～Ⅳ期60例[4]。根據組織分化程度分為低分化16例、中分化32例和高分化34例。患者初次就診癥狀主要為腹脹、腹痛、食欲不振、乏力和陰道內不規則出血等。所有患者均根據自身實際情況在安丘市人民醫院行早期全面分期手術或腫瘤細胞減滅術，術后采用以鉑類藥物為基礎的規范化化療方案。術后隨訪5年，將50例停止化療6個月后出現復發或隨訪期內一直未見復發的患者作為化療敏感組，32例停止化療6個月內（包含6個月）復發的患者作為化療耐藥組。兩組患者的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經安丘市人民醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署了對本研究的知情同意書。

1.2 試劑與儀器

兔抗人P53單克隆抗體、兔抗人livin多克隆抗體、兔抗人GST‐π單克隆抗體和兔抗人TopoⅡ單克隆抗體均購于英國Abcam公司，堿性磷酸酶羊抗兔二抗購于美國Abbkine公司。SP試劑盒和DAB顯色劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。輪轉切片機購于德國LEⅠCA公司，烤箱購于上海躍進醫療器械廠，移液槍購于美國Eppendorf公司，Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統購于北京麥克奧迪圖像技術有限公司。

1.3 檢測指標

檢測兩組化療耐藥相關蛋白P53、livin、GST‐π和TopoⅡ表達情況。

1.4 免疫組化

采用免疫組化SP法，68℃下烤片20 min，經常規二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后將切片完全浸泡于水中待用。37℃下用3%H2O2溶液將切片孵育10 min，達到抑制內源性過氧化酶活性的目的。PBS沖洗3次，轉移至0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液（pH值為6.0）中煮沸15～20 min；自然冷卻20 min后，采用物理降溫法加快冷卻至室溫，以修復抗原。PBS沖洗3次，37℃下用羊血清工作液封閉10 min，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次，滴加生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min。PBS沖洗3次，用新鮮配置的DAB溶液顯色，用自來水沖洗，反藍。用自來水沖洗后，用蘇木素復染30 s，常規脫水、透明，干燥后封片。用PBS替代一抗作為陰性對照，全程由同一高年資醫師完成，將人為誤差降到最小。

1.5 結果判定

采用二級計分法計算陽性細胞數量，在100倍物鏡下隨機選擇組織切片中5個細胞最密的區域，扭動鏡筒在400倍物鏡下進行隨機計數，記錄每100個腫瘤細胞中含有的陽性細胞數，對陽性細胞比例和染色強度進行評分。P53和TopoⅡ以細胞核出現棕黃色顆粒為陽性，陽性細胞比例＜10%為陰性，≥10%為陽性。livin和GST‐π陽性細胞比例評分：＜5%計為0分，5%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，＞75%計為4分。染色強度評分：無棕黃色顆粒計為0分，淺黃色顆粒計為1分，棕黃色顆粒計為2分，棕褐色顆粒計為3分。陽性細胞比例評分與染色強度評分相加計為總分，＜3分為陰性（－），≥3分為陽性（+）。

1.6 統計學方法

采用SPS-S 23.0軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗；計數資料以頻數和率（%）表示，采用χ2檢驗和Fisher確切概率法；繪制生存曲線，采用Log‐rank檢驗比較；采用Cox回歸模型進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P53、livin、GST-π和TopoⅡ的表達情況

P53和TopoⅡ主要分布于細胞核中，livin和GST‐π主要分布于細胞質和成細胞膜中，詳見圖1。化療敏感組P53、livin和GST‐π的陽性表達率均明顯低于化療耐藥組，差異均有統計學意義（P＜0.01）；而TopoⅡ的陽性表達率高于化療耐藥組，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表1。

2.25 年累積生存率

采用Log‐rank檢驗比較化療敏感組患者的5年累積生存率（58.3%）與化療耐藥組患者的5年累積生存率（12.5%），差異有統計學意義（χ2=6.631，P=0.010）。（圖2）

2.3 生存時間的影響因素

將患者的年齡、臨床分期、組織分化程度和化療敏感程度作為自變量納入Cox回歸模型，是否死亡作為因變量（賦值1=是，0=否）。分析上述因素對患者生存時間的影響，結果顯示：臨床分期和化療敏感程度是生存時間的影響因素（P＜0.05），詳見表2。

圖1 P53、livin、GST‐ π和TopoⅡ在上皮性卵巢癌組織中的表達

表1 兩組患者 P53、livin、GST‐ π和TopoⅡ陽性表達率的比較[ n（%）]

圖2 兩組患者的 5年累積生存率比較

3 討論

腫瘤的發生、發展和轉移是惡性腫瘤發展的基本途徑，是腫瘤與宿主之間相互作用的過程，受多種因素的影響。目前，卵巢癌的主要治療方案包括卵巢癌全面分期手術和腫瘤細胞減滅術，輔助術后規范化療，兩者并用可以獲得良好的短期療效[5‐6]。鉑類藥物可以在卵巢癌術后初期起到較好的控制癌細胞增殖和遷移的作用，然而大多數患者最終還是因為原位復發或遠處轉移導致死亡[7‐8]。化療耐藥性是導致遠期生存率偏低的重要因素，因此，研究引起原發、繼發性耐藥的靶點和機制，可以更好地檢測化療效果和預后，給予靶向治療和個體化治療方案，最終達到增加患者生存率，改善生存質量的目的。

表2 82例患者生存時間影響因素分析

化療藥物誘導腫瘤細胞凋亡是其殺滅腫瘤細胞的重要機制。研究發現，細胞凋亡是多基因共同調節的結果，凋亡調控基因的異常表達可以使患者產生化療耐藥性[9‐10]。P53是最早發現的抑癌基因，是一種細胞凋亡的相關基因。在正常細胞中P53基因不僅可以促進癌細胞凋亡，防止癌變，還可以修復細胞基因缺陷，防止細胞基因突變；然而，在大多數惡性腫瘤細胞中P53會發生突變，促使細胞癌變。livin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein，ⅠAP）的一員，不僅可以抑制細胞凋亡，還可以調節細胞周期和分裂。腫瘤細胞可以打破正常的細胞周期，抑制細胞凋亡，促進細胞無限增殖，最終形成腫瘤；因此，抑制細胞凋亡是形成腫瘤的關鍵步驟。本研究中P53和livin陽性表達患者的化療效果明顯低于陰性患者，5年累積生存率也較低。究其原因可能為：P53分為野生型和突變型，在P53陽性表達的卵巢癌患者中P53分型多為突變型，可以干擾野生型P53對細胞周期的調控，使化療藥物失去誘導腫瘤細胞凋亡的功能。livin基因在卵巢癌細胞中高表達，且在臨床分期晚期或終末期的患者中更為多見，說明livin基因在卵巢癌細胞的增殖、分化和遷移過程中起到重要的調節作用。賈敏利和宋曉彤[11]的研究發現，livin基因在卵巢癌中高表達，影響患者的臨床預后，這與本研究結果一致。

腫瘤細胞的多藥耐藥是腫瘤化療失敗的重要原因。研究表明，GST‐π和TopoⅡ等的長期刺激，可以使腫瘤細胞產生多藥耐藥[12‐13]。GST‐π是一種多功能藥物代謝酶，與細胞內解毒功能有密切的關系。臨床應用的抗癌藥物進入體內后，不能直接作用于癌細胞，需要在GST‐π的催化下與谷胱甘肽結合，才能發揮解毒作用，進而殺滅癌細胞[14]。TopoⅡ存在于細胞核中，是一種可以對DNA產生異構作用的酶，可以將DNA由一種拓撲異構體轉變成為另一種拓撲異構體，參與基因的重組、轉錄，染色單體的分離和DNA的修復過程[15]。TopoⅡ表達降低和（或）活性下降，可以導致腫瘤細胞對TopoⅡ抑制劑類化療藥物（蒽環類和鬼臼毒素類藥物）產生耐藥。本研究中GST‐π陽性表達患者的化療效果明顯低于陰性患者，5年累積生存率也較低。TopoⅡ陽性表達患者的化療效果高于陰性患者，5年累積生存率也低。究其原因，可能是癌細胞中GST‐π表達較高，藥物不能與谷胱甘肽結合并轉移，進入細胞，藥物對腫瘤細胞產生殺傷作用，從而產生細胞耐藥性；而TopoⅡ陽性表達，可能增加患者化療敏感度，但是加快其臨床進展，縮短患者的生存期。

綜上所述，P53、livin、GST‐π和 TopoⅡ可以作為上皮性卵巢癌患者化療效果和預后效果的預測指標，根據其表達情況調整治療方案，改善患者預后。

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