硼替佐米對骨髓瘤細胞株RPMI8226增殖和凋亡影響的研究

李錄克，時艷榮，趙文華

平煤神馬醫療集團總醫院血液科，河南 平頂山4670000

多發性骨髓瘤，又稱骨髓瘤、漿細胞骨髓瘤、Kaher病，是一種來源于漿細胞的惡性腫瘤[1]，是因骨髓原始漿細胞過度增殖導致的疾病，具有較高的發病率和病死率[2‐4]。多發性骨髓瘤是最為常見的血液系統惡性腫瘤之一，也是目前仍不可治愈的一種疾病。硼替佐米（bortezomib）是一種新型抗腫瘤藥物，獲美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市[5]，用于難治性、復發性、多發性骨髓瘤的治療[6‐7]，目前仍是多發性骨髓瘤的首選治療藥物。但隨著硼替佐米在臨床中的長期使用，其治療多發性骨髓瘤的效果越來越不理想，追其原因是由于多發性骨髓瘤細胞對硼替佐米產生了高度耐藥性使其復發[8]，其作用機制迄今仍不完全清楚。本實驗通過對骨髓瘤細胞株RPMⅠ8226進行體外培養，并采用增殖和凋亡實驗，觀察細胞Wnt/β‐catenin 信號通路相關蛋白β‐catenin 和 c‐myc及PⅠ3K/AKT信號通路相關蛋白Bcl‐2和Bax的表達情況，進一步探討硼替佐米對多發性骨髓瘤的調控機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

多發性骨髓瘤細胞株RPMⅠ8226購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collec‐tion，ATCC）；硼替佐米購自西安楊森制藥有限公司；10%胎牛血清購自浙江四季青公司；RPMⅠ1640培養基購自美國Hyclone公司；MTT和DMSO購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自上海艾睿生物Gibco公司；Trizol購自上海Ⅰnvitrogen公司。RNA PCR Kit Ver.3.0、SYBR Premix Ex TaqⅡ和 Annexin V‐FⅠTC/PⅠ試劑盒購自德國 Bender公司；Western Blot試劑盒購自美國KPL公司；酶標儀購自上海BⅠO‐TEK公司。流式細胞儀購自美國BD 公司；β‐actin、β‐catenin、c‐myc、Bcl‐2和 Bax 鼠抗人一抗多克隆抗體購自上海Santa Cruz公司；兔抗鼠二抗多克隆抗體購自中杉金橋生物技術有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。低溫高速離心機和二氧化碳細胞培養箱（GBB‐16）均購自上海Heraeus公司。

1.2 細胞培養

在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMⅠ1640培養基中進行多發性骨髓瘤細胞株RPMⅠ8226的懸浮培養。在37℃、5%CO2的培養箱中培養2 d后換液進行傳代培養，收集對數生長期的細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖實驗

使用MTT法檢測RPMⅠ8226細胞的增殖能力。將上述培養的對數期細胞濃度調至每孔5×103/ml后接種于96孔培養板上，每孔接種100 μl。設5個處理組，分別加入終濃度為20、40、60、80及100 nmol/L的硼替佐米，每組設置3個復孔，以不含硼替佐米的細胞作為對照組，以空白孔調零，培養 24 h，每 孔 加 入 MTT 100 μl作 用 4 h，加 入DMSO 100 μl孵育30 min。在酶標儀570 nm處測吸光度A值，根據公式計算細胞增殖抑制率：抑制率=（[A對照組－A處理組）（/A對照組－A空白組）]×100%。

1.4 細胞凋亡實驗

設硼替佐米濃度分別為20、40、60、80和100nmol/L的5個處理組和1個不含硼替佐米的對照組，取對數期生長的細胞，分別處理24 h采用后胰酶消化收集細胞，PBS洗滌，離心。取100 μl細胞懸浮液加入5 μl Annexin V‐FⅠTC和5 μl PⅠ，置于室內避光處理15 min。按照Annexin V FⅠTC/PⅠ試劑盒說明書對細胞進行染色，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，計算細胞凋亡率。每組重復3次，計算平均值。

1.5 β-catenin、c-myc、Bcl- 2和Bax mRNA表達

處理24 h后，收集各組細胞于1.5 ml離心管中，加入1 ml Trizol，提取總RNA。逆轉錄過程按照RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒說明書進行。根據SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書配制PCR反應體系25 μl，在熒光定量PCR儀中進行擴增，于2%瓊脂糖凝膠中對PCR產物進行電泳，凝膠成像觀察、照相。使用Gel‐pro Analyzer軟件進行灰度分析，以灰度反映mRNA的表達量，以β‐actin為內參，mRNA的相對含量=目的基因條帶灰度值/內參基因條帶灰度值，每組重復3次，計算平均值。各基因的引物序列，詳見表1。

表1 各基因的引物序列

1.6 WesternBlot法檢測蛋白表達

收集經0、20、40、60、80和100 nmol/L硼替佐米處理24 h后的RPMⅠ8226細胞，置于1.5 ml的離心管中，經PBS洗滌，充分裂解后，離心，提取總蛋白。其中以0 nmol/L的硼替佐米為對照組，其他為處理組。電泳結束后，轉膜，封閉，特異性一抗（鼠抗人 c‐myc、β‐catenin、Bcl‐2、Bax 和β‐actin 抗體）4℃孵育過夜。然后室溫二抗（兔抗鼠）反應1 h，ECL顯色，顯影，定影。以β‐actin為內參，計算各組蛋白的相對表達量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對-數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD‐t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 硼替佐米對RPMI8226細胞的增殖抑制作用

與對照組（0 nmol/L硼替佐米）相比，不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細胞增殖抑制率均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；且細胞增殖抑制率隨硼替佐米濃度的增加而增大，詳見圖1。經計算，硼替佐米的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentra‐tion，ⅠC50）為31.95 nmol/L。

圖1 不同濃度的硼替佐米對RPMⅠ8226細胞的增殖抑制作用

2.2 硼替佐米對RPMI8226細胞的凋亡促進作用

不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細胞凋亡率分別為（11.80±0.56）%、（19.45±1.25）%、（36.82±2.26）%、（43.56±3.50）%和（56.62±5.02）%，均高于對照組的（8.02±0.45）%，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（圖2）

圖2 硼替佐米對RPMⅠ8226細胞的凋亡促進作用

2.3 硼替佐米對 β-catenin、c-myc、Bcl- 2 和 Bax mRNA表達水平的影響

處理組c-myc、β-catenin和Bcl-2mRNA的表達水平低于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而下降；而BaxmRNA的表達水平高于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而升高。（表2）

2.4 硼替佐米對 β-catenin、c-myc、Bcl- 2和Bax蛋白表達水平的影響

處理組β‐catentin、c‐myc和Bcl‐2蛋白的表達水平低于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而下降；而Bax蛋白的表達水平高于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而升高。（圖3、表3）

表2 不同濃度的硼替佐米處理后各基因的mRNA表達水平（± s）

表2 不同濃度的硼替佐米處理后各基因的mRNA表達水平（± s）

注：與對照組比較，P＜0.05

組別對照組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μl/L 80 μmol/L 100 μmol/L 2.48±0.52 2.02±0.28 1.86±0.31 1.54±0.25*1.12±0.32*0.86±0.18*2.72±0.46 2.26±0.53 1.75±0.38*1.20±0.44*0.92±0.22*0.63±0.23*1.82±0.38 1.28±0.25 0.96±0.30*0.52±0.15*0.31±0.20*0.18±0.16*1.36±0.11 1.52±0.32 1.84±0.24*2.18±0.36*2.62±0.26*2.91±0.42**c‐mycβ‐cateninBcl‐2Bax

圖3 硼替佐米對 β‐catenin、c‐myc、Bcl‐ 2和Bax蛋白表達水平的影響

表3 不同濃度的硼替佐米處理后各蛋白的表達水平（± s）

表3 不同濃度的硼替佐米處理后各蛋白的表達水平（± s）

注：*與對照組比較，P＜0.05

組別對照組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L 80 μmol/L 100 μmol/L c‐myc 1.41±0.38 1.06±0.26 0.88±0.31*0.46±0.23*0.25±0.12*0.08±0.05*β‐catenin 1.26±0.23 1.12±0.18 0.92±0.12 0.76±0.16*0.58±0.10*0.18±0.22*Bax 0.76±0.23 0.83±0.15 0.90±0.11 0.99±0.20 1.03±0.28 1.15±0.35*Bcl‐2 1.21±0.32 0.96±0.16 0.85±0.24 0.66±0.25*0.42±0.16*0.20±0.07*

3 討論

多發性骨髓瘤多發于65歲左右的老年人，發病率與性別無關，隨著社會老齡化的進展，多發性骨髓瘤的發病率呈逐年增加趨勢[4,9]。多發性骨髓瘤的主要特征是骨髓中漿細胞克隆性增殖，分泌片段或單克隆免疫球蛋白，伴有廣泛的感染、貧血、腎功能損害及溶骨病變等臨床表現[10]。多發性骨髓瘤的治療包括初始治療、干細胞移植（stem cell transplantation，SCT）、維持治療和復發的治療。目前，多發性骨髓瘤的病因和發病機制尚未研究清楚。針對多發性骨髓瘤的難治、復發等情況，大多采用聯合用藥方案[11‐14]，但均以硼替佐米為主，硼替佐米是26S蛋白酶體抑制劑，通過阻斷細胞內多種調控細胞凋亡及信號傳導的蛋白質的降解，以及多個通路發揮著抗腫瘤作用。

本實驗采用MTT法檢測硼替佐米對骨髓瘤細胞株RPMⅠ8226的增殖抑制作用，與對照組相比，不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細胞增殖抑制率均升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；且細胞增殖抑制率隨硼替佐米濃度的增加而增大，呈劑量效應。不同濃度（20、40、60、80和100 nmol/L）硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細胞凋亡率均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。處理組 c‐myc、β‐catenin 及Bcl‐2的mRNA和蛋白表達水平均低于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而下降；而Bax的mRNA和蛋白表達水平均高于對照組，且隨硼替佐米濃度的增加而升高。

研究表明，Wnt/β‐catenin信號通路中c-myc和β-catenin基因的異常變化與多發性骨髓瘤的發生和發展密切相關[15]。硼替佐米通過抑制NF‐?B信號通路中Bax和Bcl‐2的活性阻止多發性骨髓瘤的發展[8]。這說明，在多發性骨髓瘤發生和發展的過程中，Wnt/β‐catenin和NF‐κB信號通路發揮重要作用。孫紅生[16]在研究硼替佐米對多發性骨髓瘤細胞凋亡的影響及機制中也得出，硼替佐米可誘導多發性骨髓瘤細胞凋亡，抑制Wnt/β‐catenin信號通路可能是其作用機制之一。研究已證實聯合用藥可提高多發性骨髓瘤的療效[17]，聯合用藥的作用機制不盡相同，了解硼替佐米對骨髓瘤的作用機制是尋找最好、最有效的治療方案的前提，而其對骨髓瘤細胞的作用機制還需要進一步更深入的研究。

綜上所述，硼替佐米可抑制多發性骨髓瘤細胞的增殖，促進其凋亡，作用機制可能與調控Wnt/β‐catenin和PⅠ3K/AKT信號通路有關。

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