谷氨酰轉肽酶基因工程菌發酵條件優化的研究

王夢婷，徐禮生，柴存寶，彭　靜，孫　玥，王　昕

(宿州學院 生物與食品工程學院，安徽 宿州　234000)

谷氨酰胺轉肽酶，簡稱GGT，GGT是生物體內谷胱甘肽代謝途徑的關鍵酶之一，大部分主要存在于腎、肝和脾等組織中[1-2]。正常人的血清中的谷氨酰胺轉肽酶來自于肝臟，用谷氨酰對硝基苯胺法測得正常的含量為3到50 U/L。谷氨酰胺轉肽酶是食管癌病變的標記酶[3-5]。谷氨酰胺轉肽酶對生物體內氨基酸轉運過程起著重要的作用，因此可以作為生物體代謝情況的指標[6]。本實驗利用前期篩選出性能較穩定的谷氨酰胺轉肽酶基因工程菌，通過建立一系列單因素實驗優化發酵培養基組成成分，以提高培養基發酵菌種的能力，通過提高大腸桿菌谷氨酰胺轉肽酶基因工程菌的產量進而來提高谷氨酰胺轉肽酶的產量，為谷氨酰胺轉肽酶的生產提供參考。

1　材料與方法

1.1　主要試劑和儀器設備

主要試劑: 魚粉蛋白胨、酵母浸粉均為生化試劑；乳糖、氯化鈉、氫氧化鈉；抗生素氨芐(AMP)。主要儀器: 電子天平，上海雷韻試驗儀器制造有限公司；PHS-3C Ph計，上海儀電科學儀器股份有限公司；立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司；恒溫振蕩培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；WT-ZNO無菌操作臺，鄭州中旺實驗室設備有限公司；可見分光光度計721型，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2　方法

1.2.1菌種的活化

菌種活化是將上述凍藏的原始菌種按照3%的接種量接種于LB液體培養基中，經計算本實驗需要用微量進樣器吸取100微升原始菌種于每支裝有3 mL LB液體培養基的試管中，之后還要加入7μL 的抗生素氨芐，以上操作在無菌操作臺進行，然后在37℃、170 r/min下于振蕩培養箱中培養10 h。重復上述操作活化兩代，即共活化三代即可。

1.2.2菌種的發酵

菌種的振蕩搖瓶培養是將活化后的菌種按照20%的接種量接入乳糖發酵培養基中，經計算本實驗將2 mL活化后的菌種接入100 mL的乳糖發酵培養基中。在37℃、170 r/min下于振蕩培養箱中培養發酵4 h后再調節溫度使其降至30℃繼續于振蕩培養箱中培養發酵8 h。

1.2.3菌量的測定

菌量的測定是將經搖床培養完成后的所得菌液20倍稀釋，用721型可見分光光度計在660 nm處，測定發酵培養所得菌液的光密度值OD660，上清液做等量稀釋作為空白對照。

1.2.4上清液的制備

上清液的制備是將上述發酵后所得菌液在5000 r/min下于4℃離心機中離心10min得到的上清液。

1.2.5發酵培養基的優化

1.2.5.1乳糖

本實驗用乳糖作為碳源，在保持原發酵培養基成分比例的基礎上，改變乳糖的含量，設置8個培養基，乳糖含量分別替換為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。

1.2.5.2酵母浸粉

本菌最佳發酵培養基氮源為酵母浸粉和魚粉蛋白胨，所以要分別對其進行優化建立。酵母浸粉的優化是設置8個酵母浸粉含量不同的培養基，分別把基礎發酵培養基的酵母浸粉替換為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。

1.2.5.3魚粉蛋白胨

魚粉蛋白胨的優化是在初始培養基的基礎上設置8個培養基，魚粉蛋白胨含量分別為分別換成0.7%(w/v), 0.8%(w/v), 0.9%(w/v), 1.0%(w/v), 1.1%(w/v), 1.2%(w/v)，1.3%(w/v), 1.4%(w/v)。

1.2.5.4無機鹽氯化鈉

無機鹽對微生物的生長很有意義，本實驗以氯化鈉做為無機鹽，在初始發酵培養基的基礎上，把其中的氯化鈉成分含量替換成0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。

1.2.6顯微鏡觀察

將沒有優化發酵培養基發酵得到的菌液與優化發酵培養基后發酵得到的菌體經20倍稀釋后放在倒置顯微鏡下觀察。

1.2.7統計學分析

采用SPSS11.5軟件對數據進行統計分析，以均數±標準差來表示數據，組間采用t檢驗比較[7]。

2　實驗結果與分析

2.1　單一碳源乳糖不同含量對發酵培養基產菌量的影響

乳糖為菌株發酵生長的良好碳源，本實驗設置8個培養基，乳糖含量分別為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。。發酵后于721型分光光度計下660nm處測得不同乳糖含量下發酵所得菌液光密度OD660值如圖1所示(*表示差異顯著)。

圖1　發酵培養基乳糖對菌液光密度的影響

圖2　乳糖含量為0.5%時(OD660=0.195)的菌液圖

根據上圖1分析可知，發酵培養基乳糖含量在0.35%(w/v)處菌液光密度值較低，隨著乳糖含量的增大光密度值也隨之逐漸增大，但是乳糖含量到達0.5%(w/v)時達到最大值0.195，之后再增大含量菌液光密度值不會增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，所以發酵培養基乳糖含量為0.5%(w/v)處發酵所得菌最多，由圖2可以看出OD值大時顯微鏡圖大腸桿菌微生物要多于OD值小的，說明培養基的最佳乳糖含量為0.5%(w/v)。

2.2　單一氮源酵母浸粉含量的不同對發酵培養基產菌量的影響結果

酵母浸粉含量對培養基產菌量的影響是設置8個100 mL的培養基，酵母浸粉含量在原始培養基基礎上改為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。發酵完成后于721型分光光度計下660nm處測得不同酵母浸粉含量下發酵所得菌液光密度OD660值如圖3所示(*表示差異顯著)。

圖3　酵母浸粉對菌液光密度的影響

圖4　酵母浸粉含量為0.5%時(OD660=0.193)的菌液圖

根據圖3分析可知，發酵培養基酵母浸粉含量在0.35%(w/v)處菌液光密度值較低，隨著酵母浸粉含量的增大光密度值也隨之逐漸增大，但是酵母浸粉含量到達0.5%(w/v)時達到最大值0.193，之后再增大含量菌液光密度值不會增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，由圖4可以看出OD值大時顯微鏡圖大腸桿菌微生物要多于OD值小的，說明培養基的最佳酵母浸粉含量為0.5%(w/v)。

2.3　單一氮源魚粉蛋白胨含量差異對發酵培養基產菌量的影響結果

魚粉蛋白含量對乳糖發酵培養基產菌量的影響實驗是設置8個發酵培養基，其含量在基礎培養基上改為0.7%(w/v)，0.8%(w/v)，0.9%(w/v), 1.0%(w/v)，1.1%(w/v)，1.2%(w/v)，1.3%(w/v), 1.4%(w/v)。于721型分光光度計下660 nm處測得不同魚粉蛋白胨含量下發酵所得菌液光密度OD660值如圖5所示(*表示差異顯著)。

圖5　發酵培養基魚粉蛋白胨對菌液光密度的影響

圖6　魚粉蛋白胨含量為1.0%時(OD660=0.196)的菌液圖

根據圖5分析可知，發酵培養基魚粉蛋白胨含量在0.7%(w/v)處菌液光密度值較低，隨著魚粉蛋白胨含量的增大光密度值也隨之逐漸增大，但是魚粉蛋白胨含量到達1.0%(w/v)時達到最大值0.196，之后再增大含量菌液光密度值不會增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，由圖6可以看出光密度值大的菌液觀察到的大腸桿菌微生物量多于光密度值小的，說明培養基的最佳魚粉蛋白胨含量為1.0%(w/v)。

2.4　無機鹽氯化鈉含量差異對發酵培養基產菌量的影響

氯化鈉為菌株發酵生長的良好無機鹽，本實驗設置8個培養基，氯化鈉含量分別為0.35%(w/v)，0.4%(w/v)，0.45%(w/v), 0.5%(w/v)，0.55%(w/v)，0.6%(w/v)，0.65%(w/v), 0.7%(w/v)。發酵后菌液于721型分光光度計下660nm處測得不同含量下發酵所測得菌液光密度OD660值如圖7所示(*表示差異顯著)。

圖7　發酵培養基NaCl對菌液光密度的影響

圖8　氯化鈉含量為0.5%時(OD660=0.197)的菌液圖

根據圖7分析可知，發酵培養基NaCl含量在0.35%(w/v)處菌液光密度值較低，伴隨氯化鈉的量的變大光密度值OD660也會隨之慢慢變大，但是NaCl的量到達0.5%(w/v)處OD660到達最大值，之后再增大含量菌液光密度值不會增大反而隨之逐漸減小。而菌液光密度值越大代表著菌液量越多，所以乳糖發酵培養基NaCl含量為0.5%(w/v)處菌液產量最多，說明培養基的最佳NaCl含量為0.5%(w/v)。從圖8中也看得出0.5%氯化鈉含量對乳糖發酵培養基菌體菌較多。

3　結論

在酵母浸粉的發酵培養基優化實驗中測得菌體光密度值OD660在酵母浸粉含量為0.5%時最大；在魚粉蛋白胨的發酵培養基優化實驗中測得菌體光密度值OD660在魚粉蛋白胨含量為1.0%時最大；在乳糖的發酵培養基優化實驗中測得菌體光密度值OD660在乳糖含量為0.5%時最大；在氯化鈉的發酵培養基優化實驗中測得菌體光密度值OD660在氯化鈉含量為0.5%時最大。綜合分析得結論：0.5%(w/v)的酵母浸粉，1.0%(w/v)的魚粉蛋白胨，0.5%(w/v)的乳糖，0.5%(w/v)的氯化鈉，是為最佳的乳糖發酵培養基組分組成。

[1]王小力,張亞麗.γ-谷氨酰基轉肽酶產生菌發酵培養基的優化及酶促反應研究[J].農產品加工,2010,210(6):77-80.

[2]姜新苓.血清中GGT水平與腎功能異常的相關性[J].世界最新醫學信息文摘,2015,15(73):144-145.

[3]易庚華,陳蔭椿,石仲歧,等.食管癌谷氨酰胺轉肽酶生物化學研究[J].南通醫學院學報,1992,12(1):32-34.

[4]李健,趙治國,白經修,等.食管癌高發區重度不典型增生人群谷氨酰胺轉肽酶的隨訪觀察[J].中國腫瘤臨床,2004,31(16):905-907.

[5]徐國明,孔 磊,董秀琴,等.血清Y谷氨酰胺轉肽酶對食管鱗癌患者預后價值分析[J].癌癥進展,2015,13(6):642-645.

[6]姚崇華,胡以松,翟鳳英,等.我國2002年代謝綜合征的流行情況[J].中國糖尿病雜志,2007,15(6):332-335.

[7]周璟明,陳 宏,張祝蘭,等.費氏鏈霉(Streptomyces fradiae)FIM-S38胞外產新霉素的發酵條件優化[J].生物技術通報,2014(12):92-96.