生防菌F170062發酵液理化性質研究及粗提活性初探

張曉慷，王海利，張新剛

(山東省農藥科學研究院，山東 濟南　250100)

植物病害是影響農作物高產、優質的重要因素之一，每年因植物病害給農作物造成的損失無法估量。我國是世界上人口最多的國家，防治植物病害，促進農作物增產，保障糧食安全對我國具有十分重要的意義。傳統的植物病害防治措施以施用化學農藥為主，但化學農藥存在殘留污染、誘導病菌抗性增強、造成環境污染、危害人體健康等諸多缺點[1-2]。生物農藥和生物防治以其低殘留、低毒、低抗性及環境友好等優點，逐漸被世界很多國家關注和推廣，成為解決植物病害最富前景的措施[3-4]。

黃瓜灰霉病是由灰葡萄真菌侵染引起的，主要發生于黃瓜生育期的病害，若防治不當，一般會造成10%～70%以上的減產，現已成為我國溫室大棚中黃瓜減產的主要病害之一[5-6]。同時，該病菌還能危害茄子、番茄、大蔥、青椒、韭菜等多種經濟作物和糧食作物，所以，開發高效、低毒、可靠的灰霉病防治藥物具有十分重要的現實意義。

本課題組從土壤中篩選到一株對黃瓜灰霉病具有生物防效的菌株F170062，本文對其發酵液的穩定性進行了研究，同時對發酵液中的抑菌物質的粗提活性進行了初步探索。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試菌株

供試菌株：生防菌株F170062，本實驗室保存。

靶標菌株：黃瓜灰霉病菌，由本實驗室分離鑒定并保存。

1.1.2培養基

發酵培養基：1%可溶性淀粉、2%葡萄糖、2.5%花生粉、0.1%牛肉膏、0.4%的酵母浸粉、0.2%NaCl、0.005%K2HPO4，水1000 mL，調節pH值=7.2，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶約80 mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

PDA培養基：37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基、1000 mL水，加熱煮沸溶解，分裝于500 mL三角瓶中，每瓶約300 mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

1.2　方法

1.2.1發酵粗提液的制備

取生長有F170062菌的斜面接種于發酵培養基中，在28℃，轉速220 r/min的恒溫搖床中培養4d。而后將發酵液在4000 r/min的離心機中離心10min，上清液經0.22μm的濾膜過濾，作為發酵粗提液，置于4℃的冰箱中保存備用。

1.2.2發酵粗提液抑菌活性的測定

采用有毒介質法測定發酵粗提液對供試菌株的抑菌活性。(1)取20μL發酵粗提液加入到已滅菌的培養皿中；(2)在培養皿中定量加入20 mLPDA培養基，搖晃均勻；(3)待培養基凝固后，在培養基上接種黃瓜灰霉病菌餅，放置在18℃培養箱中培養4 d，后取出采用十字交叉法測定病原菌菌落直徑，并計算抑菌率，公式如下：

抑菌率=(對照菌落直徑-處理后菌落直徑)×100/(對照菌落直徑-菌餅直徑)

如非特殊說明，本文所有試驗均設3個重復。

1.2.3發酵粗提液粗提活性試驗樣品處理

將20 mL發酵粗提液平均分成3份，分別調pH值為3、7、10，后再將每個pH值發酵粗提液再分成3份，分別作正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取、沸水15min加熱處理，萃取完成后，把有機相部分和水相部分進行分離，對每個樣品進行編號，編號如表1所示。

表1　F170062粗提液樣品編號

對處理后的樣品進行減壓旋轉蒸發，蒸發掉各自的溶劑后向樣品中加入100μL甲醇，再加入與原發酵液同體積的水，恢復到原來的體積，同時回調到原發酵液pH值。

1.2.4發酵粗提液粗提活性試驗樣品紙片的制備

在無菌室中，將濕熱滅菌處理過的紙片依次在樣品中浸取1～2min，后取出，按編號順序放置在含有黃瓜灰霉病菌孢子的PDA培養基，每個樣品重復兩次，以不放置處理樣品的含有黃瓜灰霉病孢子的PDA培養基為對照，在18℃培養箱中培養4 d，后查看結果。

1.3　粗提液穩定性測定

1.3.1熱穩定性測定

將發酵粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h，冷卻后，以未處理的發酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性。

1.3.2酸堿穩定性的測定

測定發酵粗提液pH值后，用鹽酸和氫氧化鈉將粗提液pH值調節至2、4、6、8、10、12，在室溫下放置2 h，后將pH值調回粗提液原pH值，以未處理的發酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性。

1.3.3紫外穩定性的測定

將發酵粗提液加入到無菌培養皿中，在超凈工作臺中，25W紫外燈下，距離10 cm照射1、3、5、7、9 h，以未處理的發酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉菌的抑菌活性。

1.3.4粗提液加入量

定量向培養基中加入10、20、50、100、150、200、300、400、500μL粗提液，以未處理的發酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性

2　結果與分析

2.1　粗提液的熱穩定性

將粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h，冷卻后以未處理的發酵粗提液和無菌水為對照測定抑菌活性，結果如表2所示。

表2　F170062粗提液的熱穩定性

由表2可知，當發酵粗提液在30℃、50℃下加熱1 h后，抑菌活性較原液相比并沒有發生明顯變化，但是當溫度上升到70℃時，溫度對粗提液中的抑菌物質有明顯影響，此時，對黃瓜灰霉病菌的抑菌率較未處理液降低了約10%，且隨著溫度的繼續升高，抑菌率呈明顯下降的趨勢。這說明，粗提液中的抑菌物質在低溫下有較好的穩定性，對黃瓜灰霉病菌能夠保持較強的抑制作用，但是在受熱溫度較高時，抑菌物質抑菌效果明顯變差，抑菌效果降低。

2.2　粗提液的酸堿穩定性

將菌株F170062發酵粗提液在不同pH值條件下放置2 h后，調回原始的pH值，測定抑菌活性，結果如表3所示。

表3　F170062粗提液的酸堿穩定性

由表3可知，F170062發酵粗提液在酸性和堿性條件下，其抑菌活性并沒有發生明顯變化，特別是在強酸和強堿的環境中，其抑菌物質的活性與未處理液相比，仍能保持較強的抑菌率。這說明，F170062粗提液的酸堿穩定性較好，能夠適應酸堿環境的變化。

2.3　粗提液的紫外穩定性

無菌條件下將F170062發酵粗提液用25W紫外燈照射不同時間后測定抑菌活性，結果如表4所示。

表4　F170062粗提液的紫外穩定性

如表4所示，經紫外線照射1、3、5、7、9 h后，F170062發酵粗提液的抑菌活性與未處理液相比沒有發生顯著變化，這說明，F170062發酵液中的抑菌物質有較強的紫外穩定性。紫外穩定性對抑菌物質的開發與使用至關重要。農藥的施用多在自然條件下進行，如果抑菌物質在紫外線照射下不穩定，藥效就會顯著降低，影響農藥的使用效果[7]。F170062發酵液中的抑菌物質紫外穩定性較好，有著良好的生物農藥開發前景。

2.4　粗提液投加量的影響

無菌條件下，分別取10、20、50、100、150、200、300、400、500μL發酵粗提液于培養皿中，以無菌水為對照，通過有毒介質法測定其抑菌活性，結果如表5所示。

表5　F170062粗提液投加量的影響

由表5可知，隨著F170062粗提液投加量的增加，對黃瓜灰霉菌的抑制率呈逐漸上升的趨勢，抑菌率從24.58%提升到92.50%，當粗提液投加量增加到500μL時，黃瓜灰霉病病菌已無法正常生長，這說明F170062發酵粗提液對黃瓜灰霉病菌有較好的抑菌效果。

2.5　粗提液抑菌物質粗提活性初探

由于發酵粗提液中成分復雜，包括發酵液中未利用完的培養基組分和各種各樣的發酵代謝產物，所以為方便后期抑菌物質的提取，采用紙片法探索抑菌物質合適的提取方法，并對發酵液中的粗提活性進行考察，其結果如圖1所示。

圖1　F170062粗提液紙片法試驗結果

由圖1可知，編號為6、7、10、15、16紙片周圍都有明顯的抑菌圈，其中，6：pH值=7 正丁醇萃取相；7：pH值=7乙酸乙酯萃余相；10：pH值=10、正丁醇萃取相；15：pH值=10沸水處理；16：未處理粗提液。試驗結果說明以上編號的紙片中含有F170062粗提液的抑菌物質。根據以上試驗結果可得出結論：(1)抑菌物質在中性和堿性條件下能夠被正丁醇萃取出來；(2)抑菌物質難以被乙酸乙酯萃取出來；(3)抑菌物質在堿性條件下經過沸水15min加熱處理后仍具有抑菌活性。

3　結論

通過對F170062菌發酵粗提液的熱穩定性、pH穩定性、紫外穩定性、粗提液加入量的考察發現，菌株F170062發酵粗提液在50℃以下有較好的抑菌效果，當溫度高于70℃時，發酵粗提液的抑菌活性開始下降，但是發酵粗提液經100℃處理后仍有抑菌活性；發酵粗提液在強酸和強堿的環境下和紫外輻照條件下具有較好的抑菌穩定性，抑菌效果與未處理液相差不大；隨著發酵粗提液加入量的增大，抑菌物質對黃瓜灰霉病菌的抑制能力呈逐漸增強的趨勢，當發酵粗提液加入量增加到500μL時，黃瓜灰霉病菌已經無法生長了；通過紙片法對F170062發酵粗提液的粗提活性進行初探發現，在中性和堿性條件下發酵粗提液的抑菌物質能夠被正丁醇萃取出來，這為以后F170062發酵粗提液中抑菌物質的提取方法的建立奠定了基礎。

[1]丑波.黃瓜灰霉病的發生及防治[J].現代農業,2014(9):22.

[2]齊愛勇，魏東盛，劉大群，等.番茄灰霉病拮抗細菌的篩選[J].植物保護科學，2006，22(6):311-313.

[3]朱平華. 2-氯-4,6-二甲氧基嘧啶的合成[J].當代化工，2005，34(5):330-331，334.

[4]李鵬，劉鳳英，李會芹. 除草劑吡嘧磺隆的研制[J]. 精細與專用化學品，2006，14(15):11-12，23.

[5]禹化強.大棚黃瓜主要病害的防治研究[J].中國果蔬，2015，35(2):48-52.

[6]祁連弟.沼液及不同藥劑對大棚黃瓜灰霉病防治效果的研究[J].中國沼氣，2014，32(4):73-75.

[7]Hanagan M A,Wexler B A.Herbicidal pyridine sulfonamides:US,4838926[P].1989-06-13.