HPLC法同時(shí)測定茵梔解毒顆粒中綠原酸、梔子苷和黃芩苷的含量

（安徽省獸藥飼料監(jiān)察所，安徽合肥 230091）

茵梔解毒顆粒收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[1]2017年版（中藥卷），主要由茵陳、梔子、黃芩、虎杖、鉤藤5味中藥材組成，具有清熱解毒，疏肝解痙功能，主治雛鴨病毒性肝炎[2]。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只規(guī)定了綠原酸的含量測定，梔子、黃芩也起很大作用，但未規(guī)定測定其活性成分，本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜儀，采用梯度洗脫法，同時(shí)測定了組方中茵陳、梔子、黃芩中的活性成分含量，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

美國Agilent公司高效液相色譜儀：型號(hào)HP 1100，配四聯(lián)梯度泵、在線脫氣機(jī)、二極管陣列紫外檢測器（DAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱；十萬分之一天平：德國賽多利斯，感量0.01mg，型號(hào)BS21S；

對(duì)照品：綠原酸（批號(hào)Z0261407 含量97.3%）、梔子苷（批號(hào)Z0261706含量97.3%）、黃芩苷（批號(hào)：Z0271705含量96.8%），均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；茵梔解毒顆粒（安徽奧力欣生物科技有限公司，批號(hào)：20171001）；乙腈、甲醇均為色譜純，美國FISHER Chemical公司，磷酸：分析純，上海試劑公司，超純水：水質(zhì)可達(dá)18.3MΩ·cm。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取綠原酸25.91mg、梔子苷25.35mg、黃芩苷24.85mg對(duì)照品于100ml容量瓶，加50%甲醇溶解，制成儲(chǔ)備液，分別精密量取綠原酸、梔子苷、黃芩苷儲(chǔ)備液5ml于50ml容量瓶混合，加50%甲醇定溶，制成工作液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取茵梔解毒顆粒（批號(hào)：20171001）0.7g，精密稱定，置10mL容量瓶，加熱水8ml溶解，涼至室溫，加甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

圖1 對(duì)照品色譜圖

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters公司Symmetry C18（4.6 ×250mm，5μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以0.025mol/L磷酸溶液為流動(dòng)相B，四元梯度泵在線配制，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速1.0mL/min；測定波長：240nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μl，記錄色譜圖，在此條件下，對(duì)照品溶液色譜主峰保留時(shí)間與供試品保留時(shí)間一致，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000，結(jié)果見色譜圖1。

圖2 樣品色譜圖

表1 梯度洗脫程序

3 方法學(xué)考察

3.1 線性關(guān)系考察

自動(dòng)進(jìn)樣器吸取工作液2、5、10、10、20、40μl注入HPLC，以對(duì)照品溶液濃度（μg/ml）X與其所得峰面積Y作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，綠原酸的回歸方程和線性范圍為Y=15.77X-5.74、5.04～100.84μg/ml（r=0.9998）；梔子苷回歸方程和線性范圍為Y=14.71X-5.76、5.07～100.14μg/mL（r=0.9998）；黃芩苷回歸方程和線性范圍為Y=9.29X-0.317、4.81～96.20μg/ml（r=0.9999），此范圍內(nèi)峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.2 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品工作液，按2.2色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定對(duì)照品工作液中綠原酸、梔子苷、黃芩苷的峰面積，RSD為0.34%、0.46%、0.53%（n=6），保留時(shí)間的RSD均小于1%，表明分析方法符合精密度的要求。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，在室溫下放置1、6、12、24、48h后，測定試樣中綠原酸、梔子苷、黃芩苷的峰面積，RSD為0.44%、0.68%、0.86%（n=5）。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取茵梔解毒顆粒（批號(hào)：20171001），按2.1.2方法制備6份平行樣，按2.2色譜條件注入HPLC，測定樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷的峰面積，RSD分別為0.31%、0.42%、0.50%（n=6），保留時(shí)間的RSD均小于2%。

3.5 樣品測定

取茵梔解毒顆粒，每批按2.1.2方法制備3份平行樣，按2.2色譜條件注入HPLC，測定樣品中綠原酸、梔子苷、黃芩苷的峰面積，外標(biāo)法計(jì)算樣品含量，結(jié)果綠原酸、梔子苷、黃芩苷分別為3.51、2.45、3.73（mg/g）。

4 結(jié)果與討論

4.1 樣品的處理方法

本試驗(yàn)與《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版（中藥卷）規(guī)定有較大改進(jìn)，試樣用0.1冰醋酸溶液直接溶解，綠原酸、梔子苷能夠提取出來，黃芩苷不易提取出來，改進(jìn)先用80%熱水溶解，后用甲醇定容，能將3種有效成分提取出來。

4.2 流動(dòng)相的選擇

有文獻(xiàn)報(bào)道[3]用甲醇、磷酸溶液作為流動(dòng)相，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠原酸、梔子苷、黃芩苷3種成分分離度達(dá)不到要求，雜質(zhì)有干擾。以乙腈、0.025mol/L磷酸溶液進(jìn)行梯度洗脫能夠縮短分析周期，增加靈敏度，提高分離度同時(shí)使峰型得到改善，減少拖尾和雜質(zhì)干擾。

4.3 波長的選擇

經(jīng)二極管陣列紫外檢測器（DAD）全波長掃描，梔子苷、綠原酸、黃芩苷在240nm處3種物質(zhì)有很好的吸收，采用DAD檢測器帶寬設(shè)定在4～8nm，參比波長選擇靠近測定波長附近，以扣除空白溶液影響。

本研究建立了HPLC同時(shí)測定茵梔解毒顆粒中綠原酸、梔子苷和黃芩苷的含量方法，通過試驗(yàn)，本方法精密度高，重復(fù)性好，操作簡便，適用于茵梔解毒顆粒的質(zhì)量控制。

[1]中國獸藥典委員會(huì).獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 中藥卷 [M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2017.

[2]蘭新財(cái)，趙麗麗，葉志惠，等.茵梔解毒顆粒保護(hù)肝損傷藥理作用的研究[J].中國獸藥雜志，2017，51（6）：56-63.

[3]魯曉蓉，桂雙英.HPLC法測定茵梔黃軟膠囊的含量[J].安徽醫(yī)藥，2008，12（4）：313-314.