卵巢衰老的臨床干預新進展

孫海翔，丁利軍

(1. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院生殖醫學中心，南京 210008；2. 南京大學醫學院附屬鼓樓醫院臨床干細胞研究中心，南京 210008)

自上世紀70年代以來女性壽命不斷延長，但由于經濟、社會等因素女性初次生育年齡升高，女性生育年齡高峰后移，生育力逐漸降低，隨著年齡增加卵巢功能發生生理性衰退是其主要原因[1]。我國60%以上符合二孩政策的女性年齡在35歲以上，而這部分女性的基礎卵泡儲備和卵巢反應性急劇下降[2]。此外，約1%的育齡女性受到卵巢早衰(POF)疾病的困擾[3]。這些現象的出現使得卵巢衰老的研究和臨床干預成為生殖醫學領域的焦點之一。

一、卵巢儲備及卵巢衰老

總卵巢儲備(TOR)包括非生長卵泡(原始卵泡)和周期性募集的生長卵泡，后者又稱之為功能性卵巢儲備[4]。通常所指的卵巢儲備特指功能性卵巢儲備。在臨床實際操作中，多以B超檢測中直徑2～10 mm的基礎卵泡數反映功能性卵巢儲備[5]。在既定范圍內與年齡相符的功能性卵巢儲備下降是正常的生理性卵巢衰老(NOA)。然而約10%的女性會出現與年齡不相符的功能性卵巢儲備降低，因其沒有顯著的臨床癥狀，稱為隱匿性卵巢功能不全(OPOI)[4-6]。此外，約1%的女性會在40歲之前停經，功能性卵巢儲備提前耗竭。針對這種疾病，歐洲人類生殖與胚胎協會(ESHRE)最近提出以早發性卵巢功能不全(POI)代替原有的POF概念。其推薦的POI診斷標準是：出現4個月以上的月經稀發或停經，FSH兩次檢測值高于25 U/L[7]。而原有POF的臨床表現較POI更嚴重，表現為FSH>40 U/L并伴有超過4個月的繼發性閉經[8]。ESHRE提出POI的新概念外延了POF的范圍，體現出發達國家對卵巢衰老的關注和早診斷早干預的思路。我們認為，POF可被認為是POI中更嚴重的亞類，在我國生殖醫學臨床工作中仍具有疾病分類的意義。目前卵巢衰老的診斷主要指標包括：年齡、基礎血清FSH、基礎血清抑制素B、血清抗苗勒管激素(AMH)和基礎竇卵泡數(AFC)，此外基礎卵巢體積、基礎血清E2、基礎LH/FSH比值、卵巢間質血流等指標也受到關注[3]。AMH是由早期生長卵泡分泌的，其特異性反映功能性卵巢儲備水平，且不依賴于月經周期，較為穩定。在40歲之前的卵巢衰老患者中，血清AMH值每年下降5.6%，竇卵泡(2～10 mm)計數每年下降4.4%，卵巢體積每年下降1.1%，成為預測卵巢儲備的一個可靠指標[9]。

二、卵巢衰老的機制

誘發卵巢衰老的原因，包括遺傳、DNA損傷修復、端粒、能量代謝、神經內分泌、卵巢微環境等因素。通過對POI患者進行全基因外顯子測序分析發現FOXP3、FMR1、FIGLA、FOXL2、AIRE等基因的突變與POI的發生相關[10]。動物實驗進一步證實PI3K/AKT/FoxO3通路的活化導致卵泡過度激活，成年小鼠出現POI表型[11]。脆性X智力遲緩基因1(FMR1)的RNA 5’ UTR區域的CGG重復與卵巢衰老程度呈現正相關，成為預測功能性卵巢儲備的潛在指標[12]。卵母細胞和顆粒細胞內增加的DNA雙鏈損傷和DNA修復缺陷，與卵巢衰老密切相關。抑癌基因BRCA1/2參與卵巢中的DNA雙鏈損傷修復，BRCA1突變的小鼠和人都表現出卵泡提前耗竭[13]。衰老的端粒控制理論在分裂細胞中已經得到證實，近年來在小鼠卵母細胞衰老過程中也觀察到端粒縮短、端粒酶活性降低和氧化應激損傷增加等現象[14]。卵母細胞的線粒體數量約為20～50萬，線粒體DNA拷貝數超過百萬，為卵母細胞提供能量。氧化應激引起的線粒體DNA突變增加，線粒體DNA突變的積累破壞線粒體的供能，造成卵母細胞的衰老，也是卵巢衰老的潛在機制[15]。下丘腦內側基底區的神經干細胞控制機體的衰老，下丘腦的Kisspeptin神經元和GnRH神經元，調控下丘腦-神經-垂體軸。異常增高的Kisspeptin及其受體降低卵巢的卵泡儲備，其突變與POF表型密切相關[16]。創傷、感染引起的卵巢纖維化，主要表現為間質部分膠原過度沉積和血供減少，可造成卵巢加速衰老和配子質量的下降[17]。這些因素都參與了卵巢衰老的調控，提示卵巢衰老的機制復雜性，需要進一步的深入研究。

三、改善NOA/OPOI患者臨床結局的常規臨床干預

薈萃分析顯示對于卵巢衰老的患者，拮抗劑方案相較于長方案有類似的獲卵數，而GnRH-a短方案雖然能獲得更多的卵母細胞，但臨床妊娠結局較長方案組、拮抗劑方案組沒有顯著差異[18]。對于功能性卵巢儲備降低的患者，促排卵過程中增加FSH的劑量，并不增加獲卵數，也不改善臨床結局[19]。

靈長類動物中的研究顯示，睪酮可以促進顆粒細胞上FSH受體的表達，并刺激早期卵泡的生長[20]。臨床研究表明每天使用12.5 mg的經皮睪酮處理3周后再行控制性促排卵，有助于提高卵巢衰老患者的獲卵數和活產率[20]。在卵巢衰老女性的IVF控制性促排卵周期前8周開始每天口服75 mg的脫氫表雄酮(DHEA)，臨床妊娠結局得到了顯著改善[21]。有研究進一步發現聯合補充DHEA和輔酶Q10較單純補充DHEA能增加卵巢儲備，提高患者宮腔內人工授精(IUI)和IVF周期中的基礎卵泡數，并降低IVF周期中促性腺激素的用量，但并不顯著改善卵巢儲備降低患者的臨床妊娠率及活產率[22]。拮抗劑方案-ICSI周期中補充生長激素可以顯著增加卵巢反應不良患者的臨床獲卵數、受精卵數和可移植胚胎數，但不顯著改善臨床妊娠率和活產率[23]。對于卵巢儲備降低的患者，每天口服3 mg褪黑素至FSH啟動日能顯著提高獲卵數及優質胚胎數，但臨床妊娠結局尚無統計學差異[24]。甲狀腺功能異常是育齡婦女最常見的自身免疫性內分泌紊亂疾病，有學者發現促甲狀腺激素(TSH)≥3 μIU/ml不孕患者的AMH水平顯著降低，提示甲狀腺功能影響卵巢儲備功能[25]。對于這部分卵巢儲備降低的患者，補充甲狀腺素可能提高其卵巢功能儲備。

四、POI/POF臨床干預新技術研究進展

(一)原始卵泡體外激活與卵巢組織移植改善POI患者臨床結局

卵巢組織慢速冷凍及原位移植技術的成熟，以及卵巢組織玻璃化冷凍技術的興起為生育力保存提供可行的方法，同時也使POI 患者卵巢組織的保存與體外處理成為可能[26]。在模式動物研究的基礎上，對于POI患者卵巢中殘存的卵泡，經過玻璃化冷凍結合絲氨酸/蘇氨酸激酶(AKT)體外激活后可生成成熟卵母細胞，獲得活產[27]。針對卵巢組織冷凍后卵泡存活率低的問題，新鮮組織體外激活直接移植后，14位POI患者中6位病人卵泡發育，IVF后獲得優質胚胎，并且獲得臨床活產[28]。但是，AKT通路激活劑的臨床安全性需要進一步驗證。

(二)卵巢內干細胞移植恢復POF卵巢的卵泡發育

已經證實卵巢內存在兩種干細胞：皮質下卵原干細胞和卵巢內間充質干細胞，對卵母細胞發生和卵泡發育至關重要[29-30]。干細胞包括胚胎干細胞(ESCs)、原始生殖細胞(PGCs)、間充質干細胞(MSCs)和卵源生殖干細胞(OGSCs)等，具有潛在的體外直接分化或體內修復卵巢功能的應用前景[31]。

近年來，卵泡穿刺獲得上皮來源的潛在卵原干細胞可以在體外分化成為卵母細胞樣細胞，表達卵母細胞特異性分子GDF9和ZP3，可能為POF患者體外卵母細胞發生帶來新的素材，但是其臨床應用仍需進一步研究[32]。卵巢內移植間充質干細胞恢復POF卵巢的卵泡發育，在POF模型動物中得到驗證。臍帶間充質干細胞移植到POF小鼠卵巢后定位于卵巢間質，旁分泌細胞因子肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)和胰島素生長因子1(IGF-1)等，AMH水平顯著升高，改善卵巢的卵泡發育和功能儲備[33]。間充質干細胞復合支架材料，增加干細胞多種細胞因子的分泌，移植POF模型大鼠后提高卵泡發育和產仔數[34]。通過醫院倫理委員會批準和國家衛計委干細胞臨床研究備案后，本中心在國內率先進行POF合并不孕癥患者臍帶間充質干細胞移植干預的臨床研究，14例POF患者入組后進行標準化的干細胞移植或干細胞聯合膠原移植治療。移植后3個月，干細胞組3例患者(3/6)和干細胞聯合膠原組3例患者(3/8)卵巢體積和卵巢血流量顯著增加[35]。根據Hoogland和Skouby的卵巢活動測量分類標準[36]，干細胞組1例患者(16.7%，1/6)和干細胞聯合膠原組5例患者(62.5%，5/8)移植后顯示卵泡活動，其中兩例患者獲得臨床妊娠[35]，顯示間充質干細胞聯合支架材料移植對于改善POF卵巢功能具有良好的臨床應用前景，但是仍然需要大樣本、多中心臨床研究加以驗證。

(三)卵胞漿內線粒體移植提升衰老卵巢卵母細胞質量

卵母細胞能量代謝受損是造成衰老卵巢卵母細胞和胚胎質量降低的重要原因[37]。逆轉卵母細胞衰老的方法包括胞漿置換、異體體細胞線粒體移植、自體體細胞線粒體移植，以及自體生殖系線粒體能量移植(AUGMENT)[37-41]。胞質移植明顯改善了胚胎發育情況，臨床獲得妊娠及健康胎兒[38]。然而胞質移植缺乏動物模型的驗證，移植成分復雜，線粒體基因異質性，造成 “三父母”倫理爭議，2002年美國食品藥品監督管理局(FDA)暫停相關臨床研究[39]。而異體的體細胞線粒體移植臨床效果不佳，也存在較大的倫理爭議。自體卵丘顆粒細胞線粒體移植技術，顯著改善卵母細胞質量，其受精率明顯提高，優質胚胎率升高，已出生20名健康子代[40]。近年來，卵原干細胞作為新的線粒體來源，衍生出的AUGMENT技術明顯提高受精率和優質胚胎率，顯著增加臨床妊娠率和活產率[41]。但是AUGMENT技術的臨床治療面臨取材困難、有創，卵原干細胞分離、篩選、培養較難，價格昂貴，難以被病人接受等缺點，所以開展優質種子細胞選擇和線粒體移植適應癥的相關研究非常必要。

五、總結

伴隨我國生育政策和女性生育愿望的變化，卵巢衰老患者臨床診療需求增加；卵巢衰老包含NOA、OPOI和POI，其嚴重程度又可分級；卵巢衰老的診斷標準需要結合年齡、基礎血清FSH、基礎血清抑制素B、血清AMH和基礎AFC等指標綜合判斷；卵巢衰老的機制復雜，原因多樣，造成臨床干預困難，結局不一；卵巢衰老的臨床干預，需要針對病因，分層次、個體化診療，但目前尚無統一規范；卵巢衰老臨床干預新技術的應用，應該遵循倫理保障、臨床研究先行、患者及子代的安全為首要考慮等原則。

[1] Nelson SM，Telfer EE，Anderson RA. The ageing ovary and uterus：new biological insights[J]. Hum Reprod Update，2013，19：67-83.

[2] Li Q，Geng X，Zheng W，et al. Current understanding of ovarian aging[J]. Sci China Life Sci，2012，55：659-669.

[3] Hansen KR，Craig LB，Zavy MT，et al. Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop(STRAW)staging system[J]. Menopause，2012，19：164-171.

[4] Gleicher N，Weghofer A，Barad DH. Defining ovarian reserve to better understand ovarian aging[J]. Reprod Biol Endocrinol，2011，9：23.

[5] Iliodromiti S，Iglesias Sanchez C，Messow CM,et al. Excessive age-related decline in functional ovarian reserve in infertile women：prospective cohort of 15，500 women[J]. J Clin Endocrinol Metab，2016，101：3548-3554.

[6] Shestakova IG，Radzinsky VE，Khamoshina MB. Occult form of premature ovarian insufficiency[J]. Gynecol Endocrinol，2016，32(sup2)：30-32.

[7] European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) Guideline Group on POI,Webber L，Davies M，et al. ESHRE Guideline：management of women with premature ovarian insufficiency[J]. Hum Reprod，2016，31：926-937.

[8] Sills ES，Alper MM，Walsh APH. Ovarian reserve screening in infertility：practical applications and theoretical directions for research[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2009；146：30-36.

[9] Bentzen JG，Forman JL，Johannsen TH，et al. Ovarian antral follicle subclasses and anti-müllerian hormone during normal reproductive aging[J]. J Clin Endocrinol Metab，2013，98：1602-1611.

[10] 王春慶，田秦杰. 卵巢早衰相關基因的研究進展[J]. 生殖醫學雜志，2013，22：463-467.

[11] Castrillon DH，Miao L，Kollipara R，et al. Suppression of ovarian follicle activation in mice by the transcription factor Foxo3a[J]. Science，2003，301：215-218.

[12] Rovozzo R，Korza G，Baker MW，et al. CGG repeats in the 5’UTR of FMR1 RNA regulate translation of other RNAs localized in the same RNA granules[J/OL]. PLoS One，2016，11：e0168204.

[13] Johnson J，Keefe DL. Ovarian aging：breaking up is hard to fix[J]. Sci Transl Med，2013，5：172fs5.

[14] Yamada-Fukunaga T，Yamada M，Hamatani T，et al. Age-associated telomere shortening in mouse oocytes[J]. Reprod Biol Endocrinol，2013，11：108.

[15] Cagnone GL，Tsai TS，Makanji Y，et al. Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency[J]. Sci Rep，2016，6：27-31.

[16] Fernandois D，Cruz G，Na EK，et al. Kisspeptin level in the aging ovary is regulated by the sympathetic nervous system[J]. J Endocrinol，2017，232：97-105.

[17] Briley SM，Jasti S，McCracken JM，et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary[J]. Reproduction，2016，152：245-260.

[18] Ata B，Seli E. Strategies for controlled ovarian stimulation in the setting of ovarian aging[J]. Semin Reprod Med，2015，33：436-448.

[19] Berkkanoglu M，Ozgur K. What is the optimum maximal gonadotropin dosage used in microdose flare-up cycles in poor responders?[J]. Fertil Steril，2010，94：662-665.

[20] Weil S，Vendola K，Zhou J，et al. Androgen and follicle-stimulating hormone interactions in primate ovarian follicle development[J]. J Clin Endocrinol Metab，1999，84：2951-2956.

[21] Tartagni M，Cicinelli MV，Baldini D，et al. Dehydroepiandrosterone decreases the age-related decline of the in vitro fertilization outcome in women younger than 40 years old[J]. Reprod Biol Endocrinol，2015，13：18.

[22] Gat I，Blanco Mejia S，Balakier H，et al. The use of coenzyme Q10 and DHEA during IUI and IVF cycles in patients with decreased ovarian reserve[J]. Gynecol Endocrinol，2016，32：534-537.

[23] Bassiouny YA，Dakhly DMR，Bayoumi YA，et al. Does the addition of growth hormone to the in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection antagonist protocol improve outcomes in poor responders? A randomized，controlled trial[J]. Fertil Steril，2016，105：697-702.

[24] Jahromi BN，Sadeghi S，Alipour S，et al. Effect of melatonin on the outcome of assisted reproductive technique cycles in women with diminished ovarian reserve：A double-blinded randomized clinical trial[J]. Iran J Med Sci，2017，42：73-78.

[25] Weghofer A，Barad DH，Darmon S，et al. What affects functional ovarian reserve，thyroid function or thyroid autoimmunity?[J]. Reprod Biol Endocrinol，2016，14：26.

[26] Donnez J，Dolmans MM，Pellicer A，et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue：A review of 60 cases of reimplantation[J]. Fertil Steril，2013，99：1503-1513.

[27] Suzuki N，Yoshioka N，Takae S，et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency[J]. Hum Reprod，2015，30：608-615.

[28] Zhai J，Yao G，Dong F，et al. In vitro activation of follicles and fresh tissue auto-transplantation in primary ovarian insufficiency patients[J]. J Clin Endocrinol Metab，2016，101：4405-4412.

[29] Zou K，Yuan Z，Yang Z，et al. Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries[J]. Nat Cell Biol，2009，11：631-636.

[30] Kizuka-Shibuya F，Tokuda N，Takagi K，et al. Locally existing endothelial cells and pericytes in ovarian stroma，but not bone marrow-derived vascular progenitor cells，play a central role in neovascularization during follicular development in mice[J]. J Ovarian Res，2014，7：10.

[31] Vanni VS，Viganò P，Papaleo E，et al. Advances in improving fertility in women through stem cell-based clinical platforms[J]. Expert Opin Biol Ther，2017，17：585-593.

[32] Ding X，Liu G，Xu B，et al. Human GV oocytes generated by mitotically active germ cells obtained from follicular aspirates[J]. Sci Rep，2016，6：1-17.

[33] Li J，Mao Q，He J，et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells improve the reserve function of perimenopausal ovary via a paracrine mechanism[J]. Stem Cell Res Ther，2017，8：55.

[34] Su J，Ding L，Cheng J，et al. Transplantation of adipose-derived stem cells combined with collagen scaffolds restores ovarian function in a rat model of premature ovarian insufficiency[J]. Hum Reprod，2016，31：1075-1086.

[35] Ding L，Yan G，Wang B，et al. Transplantation of UC-MSCs on collagen scaffold activates follicles in dormant ovaries of POF patients with long history of infertility[J]. Sci China Life Sci，2018.(in press).

[36] Hoogland HJ，Skouby SO. Ultrasound evaluation of ovarian activity under oral contraceptives[J]. Contraception，1993，47：583-590.

[37] Tilly JL，Sinclair DA. Germline energetics，aging，and female infertility[J]. Cell Metab，2013，17：838-850.

[38] Cohen J，Scott R，Alikani M，et al. Ooplasmic transfer in mature human oocytes[J]. Mol Hum Reprod，1998，4：269-280.

[39] Templeton A. Ooplasmic transfer--proceed with care[J]. N Engl J Med，2002，346：773-775.

[40] Tzeng CR，Hsieh RH，Au HK，et al. Mitochondria transfer(MIT)into oocyte from autologous cumulus granulosa cells(cGCs)[J]. Fertil Steril，2004，82：S53.

[41] Woods DC，Tilly JL. Autologous germline mitochondrial energy transfer(AUGMENT)in human assisted reproduction[J]. Semin Reprod Med，2015，33：410-421.