RGD肽修飾PEEK表面及其與成骨細胞的相容性

鄭延延，劉呂花，董 軍

(川北醫學院基礎醫學院，四川 南充 637000)

0 前言

特種工程塑料PEEK由于其彈性模量(3～4 GPa)接近人體皮質骨的彈性模量(6～23 GPa)，可有效避免傳統醫用金屬材料彈性模量過高造成的“應力屏蔽”效應，有望替代傳統醫用金屬材料用作骨科植入體[1-3]。但PEEK本身不具備生物活性，其表面不利于成骨細胞的黏附，植入體內后其不能與宿主骨形成良好的骨整合，這在一定程度上限制了其在臨床上的廣泛應用。植入體通過其表面與骨組織接觸，構建有利的表面物理化學性質，有望改善骨細胞在PEEK表面的黏附與生長，促進其與骨組織之間的骨整合。目前，研究者一方面利用等離子噴涂等[4-5]方法在PEEK表面制備具有生物活性的羥基磷灰石涂層來改善PEEK的生物活性；另一方面，采用等離子體處理等[6-7]手段直接改性PEEK基體表面，此方法在改善PEEK表面生物活性的同時也可避免因生物活性涂層與基體結合力差、易脫落引起炎癥等問題。由于PEEK固有的化學惰性，使得通過一般的化學手段對其進行改性極其困難。盡管研究者們進行了一些探索性工作，如利用濃硫酸處理PEEK表面構建3D多孔網絡[8]，硅烷化處理PEEK表面引入—COOH、氨基、磷酸基[9-10]，重氮化學在PEEK表面引入磷酸基[11]等，但這些方法的處理程序均較為復雜。等離子體處理不僅可以在各種基質包括非反應性材料如PEEK表面引入各種化學基團，而且同時不會改變材料的本體性質，包括力學性質[12]；此外，其處理過程較為簡單，而且已有研究利用氧氣[13]、氨氣[14]等離子體處理PEEK表面來改善其生物活性。精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成的RGD序列是許多黏附蛋白所共有的細胞間識別的最小序列，其在介導細胞黏附、遷移、生長等方面起著重要作用[15]。因此，本文首先采用丙烯酸等離子體處理PEEK表面，在其表面引入—COOH基團，進而利用此—COOH基團將RGD肽鍵合在PEEK表面，以期改善PEEK材料的生物活性。

1 實驗部分

1.1 主要原料

PEEK圓片， 450G，直徑為15 mm，江蘇君華特種工程塑料制品有限公司；

丙烯酸，分析純，美國Sigma-aldrich公司;

噻唑藍(MTT)，純度為98 %，美國Sigma-aldrich公司；

RGD，純度99.5 %，吉爾生化有限公司；

1 - (3 - 二甲氨基丙基) - 3 - 乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，純度為99 %，成都貝斯特試劑有限公司；

N - 羥基琥珀酰亞胺(NHS)，分析純，純度為99 %，成都貝斯特試劑有限公司；

2 - (N - 嗎啉)乙磺酸(MES)，分析純，純度為98 %，成都貝斯特試劑有限公司；

成骨細胞，MC3T3-E1，四川大學華西口腔疾病國家重點實驗室；

最低必需培養基(α-MEM)、磷酸鹽緩沖劑(PBS)，美國Hyclone公司。

1.2 主要設備及儀器

低溫等離子體處理儀，DT-04，蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司；

等離子體接枝汽化儀，DJ-01，蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司；

X射線光電子能譜儀(XPS)，XSAM800，英國Kratos有限公司；

水接觸角測量儀，DSA100，德國克魯士公司；

表面輪廓儀，Perthometer M1，德國Mahr公司；

萬能材料試驗機，SANS-CMT4503， 深圳SANS 公司；

掃描電子顯微鏡(SEM)，JSM-6300，日本Hitachi公司；

酶標儀，Varioskan Flash3001，美國Thermo公司。

1.3 樣品制備

PEEK表面的丙烯酸等離子體處理：丙烯酸等離子體處理PEEK表面之前，先用氬氣(Ar)等離子體處理PEEK表面以改善PEEK基體與聚丙烯酸涂層之間的黏附強度；輝光放電之前的背底真空度為8 Pa，等離子體處理的工作溫度為20 ℃；Ar等離子體處理時的真空度為32 Pa，等離子體處理的功率為300 W，處理時間為3 min；Ar等離子體處理后的真空度維持在7 Pa，并引入丙烯酸氣體(采用等離子體接枝汽化儀將丙烯酸蒸汽引入反應腔)，保持反應腔真空度為19 Pa，50 W功率下丙烯酸等離子體處理PEEK表面3 min(圖1)，待等離子體反應腔的壓力恢復到大氣壓后，移出樣品，將丙烯酸等離子體處理的PEEK樣品標記為PEEK-COOH，未處理的PEEK標記為P-PEEK；

PEEK的表面化學鍵合RGD肽：將PEEK-COOH試樣首先沒入含EDC和NHS(摩爾比2∶5)的0.1 mol/L MES(pH=6)緩沖溶液中，室溫反應2 h后，用0.1 mol/L MES沖洗，再將樣品轉入10 mL含有1 mg RGD的PBS(pH=7.4)中，室溫反應2 h(圖1)；反應后的試樣用PBS沖洗后，依次用4 mol/L尿素、1 mol/L氯化鈉各超聲清洗10 min，以去除PEEK表面物理吸附的RGD，再用大量去離子水清洗，放入干燥器中干燥；將表面鍵合有RGD的試樣標記為PEEK-RGD。

圖1 等離子體處理PEEK表面和化學鍵合RGD肽的過程示意圖Fig.1 Schematic illustration of plasma treated PEEK surface and chemical bonded RGD peptide on PEEK surface

1.4 性能測試與結構表征

XPS測試：激發源為Al Kα，起飛角為20 °，以沾污碳C1s=284.8 eV為能量參考；

水接觸角測試：用注射器將3 μL的蒸餾水垂直懸滴到樣品表面，使用接觸角測量儀自帶成像系統拍攝液滴照片并分析水接觸角的大小，每個樣品測定3個不同的區域，取平均值；

平均粗糙度(Ra)的測定：使用表面輪廓儀對PEEK表面的粗糙度進行測定，測試樣品的3個不同區域，取平均值；

拉伸強度按 GB/T 16421—1996 測試，拉伸速率為5 mm/min；

彎曲強度按 GB/T 16419—1996 測試，試驗速率為1 mm/min；

體外細胞相容性評價：采用小鼠的成骨細胞MC3T3-E1評價細胞在材料表面的黏附、鋪展行為及增殖活性，其具體操作為：在滅菌后的P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD試樣表面，以3種細胞濃度(1.0×105、2.0×104、2.5×104個/孔)進行接種；在24孔板中培養4 h后，取1.0×105個/孔細胞濃度的PEEK樣品用PBS沖洗以去除表面未黏附的細胞，用含MTT的α-MEM培養液檢測細胞的黏附情況，酶標儀上選擇490 nm波長處測定吸光度值；取2.0×104個/孔細胞濃度的PEEK樣品依次用PBS沖洗，4 %戊二醛固定，梯度乙醇(10 %、30 %、50 %、70 %、80 %、95 %、100 %)脫水，干燥后噴金，再用SEM觀察細胞在材料表面的鋪展情況；2.5×104個/孔細胞濃度的PEEK樣品，分別在培養1、4、7 d后，用含MTT的α-MEM培養液檢測細胞的增殖活性，酶標儀上選擇490 nm波長處測定吸光度值。

2 結果與討論

2.1 PEEK表面經丙烯酸等離子體處理的分析

由圖2可知，比較P-PEEK和PEEK-COOH的XPS全譜圖發現，譜圖中沒有出現新峰，說明丙烯酸等離子體處理前后，PEEK表面的元素種類沒有發生變化。但從P-PEEK和PEEK-COOH表面的高分辨C1s譜圖(圖3)來看，PEEK-COOH樣品的C1s譜圖在289.0 eV處出現了一個新的擬合峰，是典型的—COOH位置，和文獻[16]、[17]報道的結果一致。這說明PEEK表面的化學環境發生了顯著的變化，采用丙烯酸等離子體處理成功地將—COOH引入至PEEK表面。由接觸角和粗糙度測量結果(圖4)可知，PEEK表面經丙烯酸等離子體處理后，顯著改善了其表面的親水性和粗糙度，其表面的水接觸角值顯著(*P<0.05)降低，Ra顯著(*P<0.05)增加。

1—P-PEEK 2—PEEK-COOH 3—PEEK-RGD圖2 P-PEEK，PEEK-COOH和PEEK-RGD的XPS全譜圖Fig.2 XPS wide spectra of P-PEEK,PEEK-COOH and PEEK-RGD

1—C—C/C—H 2—C—O 3—CO 4—COOH 5—C—O、C—N 6—CO、OC—NH 7—COOH、NH—C(NH)—NH2(a)P-PEEK (b)PEEK-COOH (c)PEEK-RGD圖3 P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD的高分辨C1s譜圖Fig.3 C1s high-resolution XPS spectra of P-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD

注：*P<0.05，P-PEEK與PEEK-COOH和PEEK-RGD比較；圖4 P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的水接觸角和Ra值Fig.4 Water contact angle and roughness Ra of P-PEEK,PEEK-COOH and PEEK-RGD surface

2.2 PEEK表面經化學鍵合RGD肽的分析

1—NH—CO 2—NH—C(NH)—NH2圖5 PEEK-RGD的高分辨N1s譜圖Fig.5 N1s high-resolution XPS spectra of PEEK-RGD

PEEK-RGD的XPS全譜圖(圖2)中出現了RGD肽的特征N1s峰，說明RGD肽被成功引入至PEEK的表面。PEEK-RGD的高分辨N1s譜圖在400.1、401.7 eV處出現了2個擬合峰(圖5)，分別對應于酰胺鍵中的氮和胍基中的氮[18]。PEEK-RGD的高分辨N1s譜圖中，在399.0～399.6 eV處沒有擬合出RGD肽中的—NH2特征峰[19]，說明RGD肽中的—NH2基本上完全和PEEK-COOH表面的—COOH發生了反應。

從圖3的C1s譜圖中可以看出，PEEK-COOH和PEEK-RGD在287.2 eV處均有1個擬合峰，但PEEK-RGD在該處的擬合峰面積明顯比PEEK-COOH的大(表1)，這是由于RGD鍵合在PEEK的表面后，酰胺鍵中的碳也貢獻于此處[20]。和PEEK-COOH相比，PEEK-RGD的C1s譜圖中286.0 eV處擬合峰的相對面積增大，其歸因于RGD鍵合在PEEK的表面后引入的C—N鍵；289.4 eV處擬合峰的相對面積增大，其歸因于RGD鍵合在PEEK的表面后引入的羧基碳和胍基碳(表1)。PEEK表面固定RGD后，其表面的接觸角發生了輕微的降低，Ra稍有增加(圖4)。

表1 P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD的表面碳各成鍵的相對含量Tab.1 Relative composition of different C-species forP-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD

2.3 表面處理對PEEK力學性能的影響

圖6 PEEK表面改性前后的拉伸強度及彎曲強度Fig.6 Tensile strength and flexural strength of PEEKbefore and after surface treatment

采用靜態力學分析評價了丙烯酸等離子體處理和RGD肽修飾對PEEK力學性能的影響，其結果如圖6所示。由圖6可以看出，PEEK-COOH和PEEK-RGD相對于P-PEEK，其拉伸強度和彎曲強度均未發生明顯變化，說明等離子體處理和RGD肽的修飾均未影響PEEK優異的力學性能。

2.4 體外成骨細胞相容性評價

樣品，培養時間：(a)P-PEEK，4 h (b)PEEK-COOH，4 h (c)PEEK-RGD，4 h(d)P-PEEK，1 d (e)PEEK-COOH，1 d (f)PEEK-RGD，1 d圖8 成骨細胞在PEEK樣品表面培養4 h和1 d的SEM照片Fig.8 SEM of MC3T3-E1 cells on PEEK surface after culturing for 4 h and 1 d

注：*P<0.05，PEEK-RGD與P-PEEK和PEEK-COOH比較圖7 MTT法測定成骨細胞在P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的黏附情況Fig.7 Adhesion of MC3T3-E1 cells on P-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD surface measured by MTT assay

從圖7可以看出，PEEK-RGD試樣組的吸光度值最高，說明RGD顯著(*P<0.05)改善了PEEK表面成骨細胞的黏附能力；PEEK-COOH試樣組的吸光度值高于P-PEEK試樣組，說明—COOH功能化的表面也有利于成骨細胞的黏附。從成骨細胞MC3T3-E1在PEEK材料表面的黏附鋪展形貌圖(圖8)可以看出，培養4 h時，P-PEEK試樣表面的成骨細胞大多呈球形，而PEEK-COOH和PEEK-RGD試樣表面的細胞大多數呈伸展狀，且PEEK-RGD試樣表面的細胞有較多較長的絲狀偽足；培養1 d時，P-PEEK試樣表面只有部分細胞呈伸展狀，而PEEK-COOH和PEEK-RGD試樣表面的成骨細胞均表現出更好的鋪展形貌，且培養1 d時PEEK-RGD試樣表面的成骨細胞緊貼著其表面生長并鋪滿了整個材料表面，說明PEEK-RGD試樣表面具有較好的成骨細胞生長環境。

由圖9可以看出，成骨細胞MC3T3-E1在試樣表面的增殖呈現時間的依賴性，隨培養時間的延長，細胞數目明顯增加。成骨細胞MC3T3-E1在PEEK-RGD和PEEK-COOH試樣表面的增殖活性高于P-PEEK試樣，且培養4 d和7 d時，PEEK-RGD試樣表面的成骨細胞數量顯著(*P<0.05)高于PEEK-COOH試樣組，說明相對于—COOH功能化的PEEK表面，鍵合有RGD的PEEK表面更有利于成骨細胞的生長。綜上可知，表面鍵合有RGD的PEEK材料更有利于成骨細胞的鋪展與增殖。

注：*P<0.05，PEEK-RGD與P-PEEK和PEEK-COOH比較圖9 MTT法測定成骨細胞在P-PEEK、PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的增殖情況Fig.9 Proliferation of MC3T3-E1 cells on P-PEEK, PEEK-COOH and PEEK-RGD surface measured by MTT assay

已有研究結果表明，生物材料的表面潤濕性、表面化學和表面粗糙度等因素決定著細胞與材料之間的相互作用[21]。一般來說，與疏水性表面相比，親水性表面更有利于成骨細胞的黏附與生長，粗糙表面比光滑表面表現出更好的骨整合性。PEEK-COOH和PEEK-RGD的水接觸角和Ra均相近(圖4)，因此其表面較好的細胞相容性應歸因于其表面不同的化學性質。細胞鋪展是細胞開始指數增長前黏附過程中的一個必須階段，而且細胞鋪展對細胞的黏附、增殖與分化有著顯著的影響，而材料的表面化學性質在很大程度上影響著細胞鋪展[22]。培養4 h的PEEK-COOH和PEEK-RGD表面的成骨細胞呈扁平的形貌，并且成骨細胞的細胞質擴展到整個材料表面，這有利于后續成骨細胞保持較高的增殖活性。骨科植入體表面改善的成骨細胞或成骨細胞前體細胞黏附，有利于改善骨與植入體之間的骨整合和植入體長期的穩定。本文發現鍵合有RGD的PEEK表面表現出很好的成骨細胞黏附與增殖，且成骨細胞緊貼其表面生長。因此，RGD修飾的PEEK植入體植入人體后，其周圍應有更多新骨生成，與骨組織表現出更好的骨整合性。

3 結論

(1)丙烯酸等離子體處理可在PEEK表面引入—COOH基團，并通過—COOH基團可將RGD肽化學鍵合在PEEK表面；

(2)丙烯酸等離子體處理和RGD肽修飾對PEEK優異的力學性能無影響；

(3)體外細胞培養發現，相對于P-PEEK和PEEK-COOH的表面， PEEK-RGD表面更有利于成骨細胞的黏附與增殖；且成骨細胞緊貼著PEEK-RGD的表面生長，有利于PEEK-RGD植入體與骨組織形成牢固的骨整合。

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