BMP-7誘導大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元細胞分化的初步研究

白廣超，金宏亮，雷 堃，李寬新

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)存在于骨髓基質(zhì)中，具有取材方便、來源廣泛的特點，是組織工程中理想的種子細胞[1]。BMSCs是來源于中胚層的多能干細胞，在適當?shù)恼T導條件下可以向骨、軟骨及心肌細胞分化。近期研究[2]表明，BMSCs還具有跨胚層分化的能力，可以向外胚層的神經(jīng)細胞分化，這一發(fā)現(xiàn)得到了脊髓損傷研究領域的高度關注。因此，BMSCs在脊髓損傷的細胞移植治療中具有重要的研究意義及臨床應用價值。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)是β轉(zhuǎn)化因子超級家族中的一員，最早是由于其出色的成骨誘導特性被發(fā)現(xiàn)的。目前研究[3]表明BMP-7在哺乳動物的神經(jīng)組織中也有表達，并在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。胡嵐翔 等[4]在研究中發(fā)現(xiàn)，BMP-7在正常脊髓組織中的表達量很微弱，在大鼠脊髓損傷后表達量增加，在脊髓損傷的早期起到了保護作用。該研究以BMP-7為誘導劑在適宜的條件下誘導大鼠BMSCs，探討B(tài)MP-7是否具有誘導大鼠BMSCs向神經(jīng)元細胞分化的能力，為脊髓損傷的細胞移植治療開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠(10只，雄性，4～6周齡，100 g左右，SPF級)由石河子大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。大鼠給予標準飼料喂養(yǎng)，適應1周后進行實驗，所有實驗在符合動物實驗倫理要求下進行。

1.2主要試劑BMP-7(美國R&D公司)；DMEM-HG培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(奧地利PAA公司)；雙抗、胰蛋白酶(美國Hyclone公司)；L-維生素C、吲哚美辛(青島捷世康生物科技有限公司)；B27(北京Engreen公司)；NF-200鼠抗(Mouse Anti-NF200)、SYN-1兔抗(Rabbit Anti-Synapsin 1)、SABC免疫組化染色試劑盒、DBA顯色劑(武漢博士德公司)；胰島素(美國Sigma公司)；地塞米松(上海永葉生物科技有限公司)；CD29、CD44流式抗體(美國BioLegend公司)。

1.3主要儀器熒光倒置相差顯微鏡(德國蔡司公司)；流式細胞儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Scientific公司)；水浴鍋(上海博迅公司)；CO2培養(yǎng)箱(北京阿爾泰科技發(fā)展有限公司)；純水器(成都超純科技有限公司)。

1.4實驗方法

1.4.1大鼠BMSCs的提取、分離和培養(yǎng) 取1只SD大鼠，進行稱重、記錄，以頸椎脫臼法處死，腹部剪“十”字后，打開腹腔，逐漸分離出股骨及脛骨，分離出的股骨、脛骨放入75%酒精中浸泡5 min后再放入PBS內(nèi)，轉(zhuǎn)入生物安全柜，組織剪剪除股骨、脛骨兩端，露出骨髓腔，2.5 ml注射器抽取完全培養(yǎng)液交替沖洗骨頭兩端，直至骨頭呈現(xiàn)為透明。收集細胞懸液，反復吹打。細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×107個/ml接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)至48 h后進行半換液，隨后每3 d進行全換液。待到細胞融合至80%左右時以0.25% 胰蛋白酶進行消化，按1 ∶2進行傳代培養(yǎng)。

1.4.2流式細胞儀檢測大鼠BMSCs表面標志物 取第3代大鼠BMSCs 1×106個細胞進行CD29-PE，CD44-FITC染色，以不含抗體的細胞為陰性對照組，避光、室溫環(huán)境孵育30 min，隨后進行流式細胞儀檢測。

1.4.3大鼠BMSCs成脂誘導及油紅O染色鑒定 成脂誘導：取培養(yǎng)至第3代的大鼠BMSCs接種至6孔板，按2×105個/孔進行接種，培養(yǎng)至24 h加入成脂誘導液(94.498%DMEM+4%FBS+1%雙抗+0.4%地塞米松+0.1%胰島素+0.002%吲哚美辛)，每3 d進行全換液及倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。誘導至28 d，進行油紅O染色鑒定脂肪細胞。

油紅O染色：儲備液和稀釋液按照5 ∶2混勻后用漏斗過濾，以PBS洗細胞兩遍，加應用液，15 min后棄去應用液，以PBS洗2遍，純水洗2遍，加復染液進行復染，5 min后棄去復染液，PBS洗2遍，純水洗3遍，滴加封固劑進行封片，置于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.4.4MTT法檢測不同濃度BMP-7對BMSCs增殖的影響 取第3代BMSCs，分為調(diào)零組、對照組(DMEM+FBS)、BMP-7干預組(DMEM+FBS+25、50、75、100 ng/ml BMP-7)，設置6個時間點，每個時間點設置5個復孔。調(diào)整細胞懸液密度接種到96孔板，每孔種8×103個細胞，補充培養(yǎng)液至200 μl，邊緣孔用無菌生理鹽水填充，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后換各組對應的培養(yǎng)液。隨后每天測定A490 nm：每孔加入20 μl MTT 溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液后每孔加入150 μl 二甲基亞砜。置于酶聯(lián)免疫檢測儀中，設置震蕩10 min，測各孔490 nm處吸光度，繪制曲線。

1.4.5大鼠BMSCs的誘導分化 取第3代大鼠BMSCs，調(diào)整密度為4×104個/ml接種到48孔板，每孔接種500 μl細胞懸液，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 h后，棄去培養(yǎng)液，換為誘導液，細胞隨機分為3組：① 陰性對照組：DMEM-HG+10%胎牛血清；② 陽性對照組：DMEM-HG+β-巰基乙醇(5 mmol/L)；③ BMP-7誘導組：DMEM-HG+BMP-7(75 ng/ml)。各組細胞誘導開始后每隔1 h置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

1.4.6免疫組化法檢測各實驗組神經(jīng)元標志物NF-200及SYN-1的表達 取各實驗孔，棄誘導液，冰的4%多聚甲醛室溫下固定30 min，PBS沖洗5 min×3次。3% H2O2室溫浸泡30 min，蒸餾水沖洗5 min×3次，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，棄多余液體，加一抗(NF-200、SYN-1)，4 ℃過夜。PBS沖洗2 min×3次，滴加二抗，室溫孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次，滴加試劑SABC，室溫孵育20 min。隨后進行DAB顯色，蘇木精輕度復染染核約1 min，用1% HCl酒精洗滌10 s。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，在倒置相差顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1大鼠BMSCs的形態(tài)學觀察骨髓細胞接種于培養(yǎng)瓶后，細胞呈圓型，大小不一，懸浮于培養(yǎng)液中。2 d半換液后可見部分細胞已貼壁，貼壁細胞呈短梭形或多角形。第5天進行全換液去除未貼壁的雜質(zhì)細胞，可見短梭形、星形細胞分散貼壁生長，以梭形細胞為主，胞質(zhì)豐富，胞核大、核仁清晰。培養(yǎng)至8 d細胞融合約90%，進行傳代，消化傳代后，傳代細胞4 h完全貼壁生長，細胞形態(tài)均一呈梭形，細胞生長旺盛，3 d可進行下一次傳代。細胞傳至第3代時，細胞聚集生長呈“魚尾紋”狀，見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下第3代大鼠BMSCs ×200

2.2大鼠BMSCs的鑒定

2.2.1大鼠BMSCs的細胞表型(CD29、CD44)鑒定結(jié)果 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs均一表達CD29、CD44，陽性率分別為99.44%、99.17%，見圖2。

2.2.2大鼠BMSCs的成脂誘導及油紅O染色 誘導后細胞大小未發(fā)生明顯變化，形態(tài)由原先的長梭條形變?yōu)椴灰?guī)則形，分散生長在培養(yǎng)瓶底。誘導2周后胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴，聚集分布在胞質(zhì)邊緣，隨著誘導時間的延長逐漸增大增多，經(jīng)油紅O染色后成橘紅色，見圖3。

圖2 流式細胞儀檢測CD29、CD44的表達

圖3 大鼠BMSCs成脂誘導后油紅O染色 ×200

2.3不同濃度BMP-7對大鼠BMSCs增殖的影響各組細胞接種后均出現(xiàn)短暫的停滯期，隨后細胞生長加速，增殖明顯，進入細胞生長對數(shù)期，第5天后增殖速度明顯減慢，進入平臺期。不同濃度BMP-7均對大鼠BMSCs增殖有促進作用，見表1，同一時間點5組細胞進行方差分析q檢驗，結(jié)果表明75 ng/ml BMP-7促進大鼠BMSCs增殖作用最顯著，采用75 ng/ml BMP-7進行后續(xù)實驗。

2.4大鼠BMSCs誘導后形態(tài)學觀察① 陽性對照組:加入5 mmol/l β-巰基乙醇30 min后觀察到部分細胞胞體折光性增強，細胞形成突起，隨著誘導時間的延長突起的數(shù)量逐漸增多且長度逐漸增長，誘導1 h后可見典型的神經(jīng)元樣細胞形態(tài)改變，2 h后神經(jīng)元樣細胞明顯增多，次級分支出現(xiàn)(圖4B)，6 h后神經(jīng)元樣細胞逐漸裂解、死亡。② BMP-7誘導組：與陽性對照組相比，含75 ng/mlBMP-7的誘導液加入后細胞形態(tài)學變化較陽性對照組出現(xiàn)早，細胞改變與陽性對照組相似，細胞突起較前者多，部分細胞突起與相鄰細胞的突起形成連接(圖4C紅色箭頭處可見)，由于2 h后神經(jīng)元樣細胞數(shù)量達到最多，故后續(xù)觀察及免疫細胞化學檢測時間點均選用2 h。③ 陰性對照組絕大多數(shù)細胞無明顯形態(tài)學改變，未見較典型的神經(jīng)元樣細胞(圖4A)。

2.5各組細胞經(jīng)誘導后神經(jīng)元標志物的表達情況陰性對照組不表達神經(jīng)絲蛋白NF-200及突觸素SYN-1，陽性對照組及BMP-7誘導組均有細胞表達NF-200及SYN-1，可見NF-200及SYN-1陽性細胞胞質(zhì)被染成亮棕黃色，NF-200及SYN-1陽性顆粒分布于胞體和軸突，見圖5。

3 討論

脊髓損傷的治療與修復是當前世界性的醫(yī)學難題。脊髓損傷后局部神經(jīng)元細胞大量死亡，直接引起反射弧及神經(jīng)傳導的中斷，再加上局部炎性因子的升高及細胞死亡裂解后釋放的有毒物質(zhì)，形成了一系列不利于神經(jīng)細胞生存的內(nèi)環(huán)境。傳統(tǒng)的藥物+手術的治療方法只能減輕脊髓受損部位的水腫情況及恢復脊柱的穩(wěn)定性，而受損的神經(jīng)元由于其為永久性細胞則不能得到補充，在此種情景下快速直接地補充神經(jīng)元細胞或干細胞顯得尤為重要[5]。BMSCs來源廣、取材易、排斥小，目前研究[6]證實其具有跨胚層向神經(jīng)細胞分化的能力，故BMSCs是治療脊髓損傷理想的“種子細胞”。目前在體外誘導BMSCs向神經(jīng)細胞分化的方法主要有3種: 化學誘導、生長因子誘導和中藥成分誘導?；瘜W誘導劑中以β-巰基乙醇應用最為廣泛，Darabi et al[7]在研究中利用β-巰基乙醇誘導大鼠BMSCs，誘導得到的細胞形態(tài)上與神經(jīng)元細胞類似，且陽性表達神經(jīng)元細胞標志物，因此本研究選取其為陽性對照。BMP-7是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族重要的一員，目前研究[8]顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族幾乎無所不能，其信號通路涉及細胞增殖與分化、胚胎發(fā)育、器官形成、組織修復與再生甚至癌癥的發(fā)生。BMP-7最早被發(fā)現(xiàn)具有成骨能力，近年來越來越多的研究揭示了BMP-7與神經(jīng)損傷修復關系密切，Luan et al[9]發(fā)現(xiàn)提高BMP-7的表達量可以減輕缺血缺氧對神經(jīng)系統(tǒng)造成的損傷，推斷BMP-7具有修復受損神經(jīng)系統(tǒng)作用。因此本研究推測BMP-7可以誘導BMSCs向神經(jīng)元細胞分化，從而在脊髓損傷中起神經(jīng)保護作用。

表1 各時間點不同濃度BMP-7干預組在490 nm處吸光度值(n=5)

圖4 大鼠BMSCs誘導2 h形態(tài)學觀察 ×200A：陰性對照組；B：陽性對照組；C：BMP-7誘導組

圖5 各誘導組神經(jīng)元標志物的表達 ×200A：陰性對照組；B：陽性對照組；C：BMP-7誘導組；1：NF-200；2：SYN-1

本實驗利用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs，應用流式細胞儀檢測第3代細胞表面標志物的表達，結(jié)果CD29、CD44陽性表達，表達率分別為99.44%、99.17%，提示所分離培養(yǎng)的細胞為純度較高的BMSCs。隨后對第3代大鼠BMSCs進行成脂誘導，結(jié)果為陽性，證明所得到的BMSCs具有良好的分化能力。利用MTT法測定不同濃度的BMP-7對BMSCs增殖的影響，結(jié)果顯示BMP-7可以促進大鼠BMSCs的增殖，抑制其凋亡，其中75 ng/ml BMP-7效果最為顯著。故本實驗選取純度較高且分化能力良好的第3代大鼠BMSCs及75 ng/ml的BMP-7進行下一步的誘導實驗研究。

本實驗使用75 ng/ml的BMP-7對貼壁培養(yǎng)2 h的大鼠BMSCs進行誘導, 誘導2 h后大部分細胞形態(tài)發(fā)生變化，形成軸突和樹突，細胞之間形成聯(lián)系，這些變化與陽性對照組相同，而陰性對照組無明顯變化。進行免疫細胞化學實驗檢測神經(jīng)標志物表達情況，結(jié)果顯示NF-200及SYN-1均為陽性，NF-200在神經(jīng)元細胞內(nèi)合成、儲存，是構成神經(jīng)元胞體和神經(jīng)軸突細胞骨架的主要成分，在維持神經(jīng)元細胞獨特的形態(tài)特征、軸漿運輸、大腦發(fā)育以及神經(jīng)元再生和可塑性方面發(fā)揮著重要作用[10-12]；SYN1 是分布于突觸前囊泡膜上的糖蛋白，參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸可塑性的調(diào)節(jié)，其表達量的高低反映了突觸的形成和密度[13-15]。本研究結(jié)果顯示, 誘導后2 h 的NF-200表達陽性, 表明BMP-7誘導大鼠BMSCs不僅形態(tài)上發(fā)生了變化，而且在分子水平上也發(fā)生了改變，陽性表達了神經(jīng)元細胞特異性標志物，證明BMP-7成功誘導大鼠BMSCs向神經(jīng)元樣細胞分化；突觸素SYN1同樣陽性表達，表明誘導得到的神經(jīng)元樣細胞不僅在形態(tài)上及標志物表達上與神經(jīng)元細胞接近，還有可能形成了完整的突觸，具有神經(jīng)元細胞的神經(jīng)傳遞功能。

近年來研究[15-17]表明BMP-2及BMP-4在BMSCs的神經(jīng)元細胞分化過程中起抑制作用，而同為骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的BMP-7在本實驗中證實其可以誘導大鼠BMSCs向神經(jīng)元細胞分化。目前BMP-2及BMP-4的生理作用及相關信號通路研究較多且取得了較多成果，而BMP-7的信號通路爭議點依然很多。本研究開創(chuàng)性的使用BMP-7誘導大鼠BMSCs向神經(jīng)元細胞分化，成功誘導了大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元樣細胞，為脊髓損傷的干細胞治療提供了新的思路，但誘導得到的神經(jīng)元樣細胞是否具有完整的神經(jīng)元細胞的神經(jīng)傳遞功能及其具體的誘導機制尚需進一步的研究。

[1] Gu C, Li H, Wang C, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells decrease CHOP expression and neuronal apoptosis after spinal cord injury[J]. Neurosci Lett,2017,636:282-9.

[2] Xu J, Lu H, Miao Z N, et al. Immunoregulatory effect of neuronal-like cells in inducting differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(24):5041-8.

[3] Liu F, Placzek M. Axon guidance effects of classical morphogens Shh and BMP7 in the hypothalamo-pituitary system[J]. Neurosci Lett, 2014, 562:108-13.

[4] 胡嵐翔. BMP-7對大鼠(環(huán)扎法)急性脊髓損傷后GFAP的表達的影響[D]. 蕪湖：皖南醫(yī)學院, 2014.

[5] Badner A, Siddiqui A M, Fehlings M G. Spinal cord injuries: how could cell therapy help[J]. Expert Opin Biol Ther, 2017,17(5):529-41.

[6] Zheng Y, Huang C, Liu F, et al. Comparison of the neuronal differentiation abilities of bone marrowderived and adipose tissuederived mesenchymal stem cells[J]. Mol Med Rep, 2017,16(4):3877-6.

[7] Darabi S, Tiraihi T, Delshad A R, et al. A new multistep induction protocol for the transdifferentiation of bone marrow stromal stem cells into GABAergic neuron-like cells[J].Iran Biomed J,2013,17(1):8-14.

[8] Park Y M, Lee W T, Bokara K K, et al. The multifaceted effects of agmatine on functional recovery after spinal cord injury through modulations of BMP-2/4/7 expressions in neurons and glial cells[J]. PLoS One,2013,8(1):e53911.

[9] Luan L, Yang X, Zhou C, et al. Post-hypoxic and ischemic neuroprotection of BMP-7 in the cerebral cortex and caudate-putamen tissue of rat[J]. Acta Histochem,2015,117(2):148-54.

[10] Wang L J, Zhang R P, Li J D. Transplantation of neurotrophin-3-expressing bone mesenchymal stem cells improves recovery in a rat model of spinal cord injury[J]. Acta Neurochir (Wien),2014,156(7):1409-18.

[11] Jia Y, Wu D, Zhang R, et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells expressing the Shh transgene promotes functional recovery after spinal cord injury in rats[J]. Neurosci Lett,2014,573:46-51.

[12] Okuda A, Horii-Hayashi N, Sasagawa T, et al. Bone marrow stromal cell sheets may promote axonal regeneration and functional recovery with suppression of glial scar formation after spinal cord transection injury in rats[J]. J Neurosurg Spine,2017,26(3):388-95.

[13] Manthou M, Abdulla D S, Pavlov S P, et al. Whole body vibration (WBV) following spinal cord injury (SCI) in rats: Timing of intervention[J]. Restor Neurol Neurosci,2017,35(2):185-216.

[14] Yin Y M, Lu Y, Zhang L X, et al. Bone marrow stromal cells transplantation combined with ultrashortwave therapy promotes functional recovery on spinal cord injury in rats[J]. Synapse,2015,69(3):139-47.

[15] Jiqing C, Yaqin L, Yingyin L, et al. BMP4 inhibits myogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in mdx mice[J]. Cytotherapy, 2015,17(9):1213-9.

[16] 李海太, 申才良, 宋旆文,等. BMP-4對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)歸影響的實驗研究[J]. 安徽醫(yī)科大學學報, 2016, 51(2):205-9.

[17] Saxena M, Prashar P, Yadav P S, et al. Mouse bone marrow stromal cells differentiate to neuron-like cells upon inhibition of BMP signaling[J]. Differentiation,2016,92(1-2):1-9.