TLR7激活上調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖

劉 莉，李 磊，顧亞男，周 宏，羅 欣，張勝權(quán)

宮頸癌在世界上是第二個(gè)主要引起女性癌癥死亡的疾病[1]，引起女性宮頸癌的主要原因是人乳頭狀瘤病毒感染。此外，一些其他的致病因子，例如普通細(xì)菌、病毒和原生動(dòng)物病原體感染女性生殖道引起黏膜炎癥參與宮頸癌的發(fā)生[2]。

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種重要的模式識(shí)別受體廣泛表達(dá)在天然免疫系統(tǒng)，是一類I型跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成。TLRs在固有免疫和獲得性免疫中扮演著重要的角色。Toll樣受體7(TLR7)是Toll樣受體家族成員之一，位于核內(nèi)體表面[3]，能夠識(shí)別單鏈RNA，包括人類免疫缺陷病毒、流感病毒、水皰性口炎病毒等[4-5]。TLRs家族的信號(hào)機(jī)制是依賴于胞質(zhì)區(qū)的接頭蛋白分子和激酶進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。根據(jù)接頭蛋白的不同，可以分為銜接蛋白(MyD88)依賴性和非依賴性途徑。定位于胞內(nèi)的TLR7與配體識(shí)別后，募集TIR結(jié)構(gòu)域，激活有絲分裂原激活蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號(hào)途徑，進(jìn)而調(diào)控促炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)，發(fā)揮其抗病毒及抗腫瘤作用[6-7]。咪唑喹啉類(Imiquimod)是一種新型的具有核苷類似物結(jié)構(gòu)的家族成員之一，可以激活TLR7信號(hào)通路，但其機(jī)制尚不完全清楚。咪唑喹啉衍生物(Gardiquimod)與Imiquimod都是TLR7激動(dòng)劑，能夠激活TLR7信號(hào)途徑，但與Imiquimod相比較，Gardiquimod在腫瘤治療中展現(xiàn)出更大的潛在發(fā)展性[8]。前期研究[9]顯示Gardiquimod能夠促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖，該研究進(jìn)一步探討了Gardiquimod激活TLR7通路促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑Hela細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；胎牛血清和DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰酶、RIPA裂解液、青霉素鏈霉素溶液及周期試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物公司；MTS試劑盒及Gardiquimod購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Cyclin B1、Cyclin E及β-actin均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞Hela生長(zhǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素溶液的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(MTS) 胰酶消化收集Hela細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×104/ml，分別接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)箱貼壁24 h，加入Gardiquimod藥液，使終濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 μg/ml，并設(shè)對(duì)照組(0 μg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入MTS試劑，放入溫箱孵育3 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度。同上述方法種96孔板，加入終濃度為2 μg/ml的Gardiquimod藥液，作用時(shí)間分別為1～5 d，對(duì)照組培養(yǎng)液加入相同濃度的PBS，5 d后加入MTS試劑，放入溫箱孵育3 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度。根據(jù)對(duì)照組數(shù)值計(jì)算每組細(xì)胞存活率。

1.2.3細(xì)胞周期檢測(cè) 胰酶消化收集Hela細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/ml，分別接種于12孔板，每孔加入1 ml，培養(yǎng)箱貼壁24 h，加入終濃度為2 μg/ml的Gardiquimod藥液，作用時(shí)間分別為1～5 d，對(duì)照組培養(yǎng)液加入相同濃度的PBS。胰酶消化再次收集細(xì)胞，按照周期試劑盒操作指南，室溫下避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，采用Flowjo軟件分析細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測(cè)周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E的表達(dá) 胰酶消化收集Hela細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/ml，分別接種于24孔板，每孔加入0.5 ml，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%匯合時(shí)加入終濃度為2 μg/ml的Gardiquimod藥液，作用時(shí)間分別為0.2、0.5、1、3、6、12、24 h并設(shè)置對(duì)照組。培養(yǎng)后收集每組細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，按10 μl/孔上樣量加入10%凝膠孔中，依次進(jìn)行：電泳(濃縮膠60 V，分離膠120 V約2 h)、轉(zhuǎn)移(300 mA恒流1.5 h)、封閉(5%的脫脂牛奶常溫封閉2 h)、孵育一抗(4 ℃孵育過夜)、孵育二抗(常溫?fù)u床孵育2 h)、Thermo Scientific SuperSignal West Pico Trial Kit化學(xué)發(fā)光底物顯影，分析周期蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1Gardiquimod促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖隨著Gardiquimod藥物濃度的增加，細(xì)胞相對(duì)存活率呈明顯的上升趨勢(shì)，當(dāng)Gardiquimod藥液濃度為2 μg/ml時(shí)Hela細(xì)胞相對(duì)存活率最大(130%),與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)Gardiquimod藥物濃度一定時(shí)，隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞相對(duì)存活率增加，在第5天相對(duì)存活率最大(135%)，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

2.2Gardiquimod對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響當(dāng)Gardiquimod藥物濃度(2 μg/ml)一定時(shí)，隨著時(shí)間的增加，Hela細(xì)胞周期中的S期呈逐漸上升趨勢(shì)，第2、4、5天實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞DNA平均含量為14.85%、16.06% 和19.09%，與對(duì)照組(10.96%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=32.997,P<0.05)。G0/G1期隨著作用時(shí)間的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),第2、4、5天實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞DNA平均含量為74.36%、74.01%和73.11%，與對(duì)照組(81.85%)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=54.585，P<0.05)。而G2/M期細(xì)胞無明顯變化。見圖2。

2.3周期蛋白CyclinB1、CyclinE的表達(dá)Western blot結(jié)果顯示經(jīng)Gardiquimod處理Hela細(xì)胞后，隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)Cyclin B1、Cyclin E蛋白的含量明顯增加，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 MTS分析Gardiquimod不同濃度和不同時(shí)間對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

A:不同濃度的Gardiquimod作用Hela細(xì)胞72 h后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；B:Gardiquimod(2 μg/ml)作用Hela細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞增殖的影響；與對(duì)照組(0 μg/ml)比較：*P<0.05

3 討論

TLRs通過識(shí)別保守的病原體相關(guān)的分子位點(diǎn)，例如細(xì)菌的脂多糖、脂肽，或者是細(xì)菌和病毒的DNA、RNA 等，誘發(fā)獲得性免疫反應(yīng)。此外TLR7還廣泛表達(dá)于多種組織和細(xì)胞，包括DC、B、T 細(xì)胞等。

圖2Gardiquimod作用Hela細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞周期的影響

A：Gardiquimod作用Hela細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)細(xì)胞周期的影響；B：分析Gardiquimod作用Hela細(xì)胞不同時(shí)間后各細(xì)胞周期所占比例；1：對(duì)照組；2：第1天；3：第2天；4：第3天；5：第4天；6：第5天；與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖3 Western blot分析Cyclin B1、Cyclin E的表達(dá)

A：Gardiquimod作用Hela細(xì)胞不同時(shí)間后對(duì)Cyclin B1、Cyclin E表達(dá)的影響；B：分析Cyclin B1的表達(dá)；C：分析Cyclin E的表達(dá)；1：對(duì)照組；2：0.2 h；3：0.5 h；4：1 h；5：3 h；6：6 h；7：12 h；8：24 h；與對(duì)照組比較：*P<0.05

TLR7激活后可誘導(dǎo)多種炎癥因子表達(dá)，包括白介素-10、白介素-12、白介素-23、干擾素γ、白介素-2等。研究[10]顯示TLR7的激活在人乳頭狀瘤病毒感染引起的癌癥治療中通過增加巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞的活性從而抑制腫瘤的增殖。Gardiquimod，TLR7激動(dòng)劑，在鼠科動(dòng)物前列腺癌和膀胱癌中對(duì)腫瘤的增殖具有抑制作用并且在細(xì)胞周期的G2/M期產(chǎn)生阻滯作用[11]。然而，本研究顯示：當(dāng)Gardiquimod作用Hela細(xì)胞后，S期DNA增加明顯，細(xì)胞增殖旺盛。國(guó)外研究[12]顯示，Cyclin E經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，這種過度表達(dá)與乳腺癌患者的生存率下降有關(guān)。本研究顯示：細(xì)胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin E隨著Gardiquimod作用時(shí)間的增加而增加， TLR7信號(hào)通路激活后引起細(xì)胞周期的改變，周期蛋白水平也隨之改變。Cyclin B1、Cyclin E 的上調(diào)可能參與TLR7信號(hào)通路的激活從而促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖。這一研究結(jié)果提示Gardiquimod對(duì)不同的腫瘤可能存在不同的作用，甚至是相反的結(jié)果，具體機(jī)制待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Gardiquimod引起Hela細(xì)胞周期和周期蛋白發(fā)生了變化，并對(duì)Hela細(xì)胞的增殖起到了一定的促進(jìn)作用，首次發(fā)現(xiàn)了TLR7的激活與宮頸癌細(xì)胞增殖的相關(guān)關(guān)系，為研究宮頸癌提供了一個(gè)新的思路。

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