柿餅污染霉菌的分離鑒定及生物學特性研究

張倩 白冬紅 張晶 陳義倫 辛力

摘要：為控制柿餅霉變，以發霉的小萼子柿餅為原料，對其中霉菌進行分離純化，并對主要霉菌進行鑒定和生物學特性研究。結果表明，從發霉柿餅中分離得到兩株優勢菌S1和S2，通過形態學和分子生物學鑒定，S1為產黃青霉，S2為黑曲霉；菌株S1產黃青霉的最適生長條件為：溫度25℃，濕度大于70%，pH 5～7，熱致死溫度和時間為65℃、5 min或70℃、1 min；菌株S2黑曲霉的最適生長條件為：溫度30℃，濕度大于70%，pH 5，熱致死溫度和時間為65℃、15 min或70℃、1 min。

關鍵詞：柿餅；霉菌；分離與鑒定；生物學特性

中圖分類號：S665.209文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）02-0076-07

Abstract Using the moldy dried persimmon of Small Calyx as experimental materials， the main mold strains were isolated and identified by morphological and molecular biological methods， and their biological characteristics were also studied. Two dominant strains， named S1 and S2 were isolated and identified as Penicillium chrysogenum and Aspergillus niger respectively by morphological and molecular biological methods. The optimal growth conditions for S1 strain were temperature as 25℃， humidity as more than 70%， pH value as 5.0～7.0，thermal death point and time as 65℃ and 5 minutes or 70℃and 1 minute. The optimal growth conditions for S2 strain were temperature as 30℃， humidity as more than 70%， pH value as 5.0， thermal death point and time as 65℃ and 15 minutes or 70℃ and 1 minutes.

Keywords Dried persimmon； Mold； Isolation and identification； Biological characteristics

柿（Diospyros kaki） 原產于我國，是我國重要的特色水果之一。我國柿品種繁多，據全國柿資源調查統計，有1 058種，其中大多數是我國特有品種[1]。柿餅由于加工制作簡單、耐貯藏運輸而成為柿子加工的主產品。柿餅富含果糖、葡萄糖、天然有機酸、錳、鈣、維生素等，是養生食品中的佳品[2]，且頗具醫療保健作用[3]。柿餅中還含有較多的天然抗氧化物，可以防止一些疾病的發生[4，5]。

柿子資源豐富，且采收期短，所以將不宜鮮食的柿子加工成柿餅是一個很好的選擇。傳統的柿餅加工多采用自然干制法，該法基本靠露天曬和風吹，需要長達數月的時間來完成干燥，且多由各家各戶分散加工，生產條件粗放，生產的標準化、機械化和規模化程度均較低，加上柿子糖含量偏高，柿餅很容易受到微生物主要是霉菌的污染[6]，產品衛生質量較差[7]。

在我國，含水量較高的柿餅（30%～40%）一般采用冷凍或冷藏保存，柿餅進入零售市場（超市）后，往往所處環境為常溫，散裝柿餅會很快失水干縮變硬，口感品質劣變，嚴重影響銷售；密封保濕包裝，則隨著柿餅中二氧化硫的散失，柿上會有霉菌生長，存在衛生安全問題。而且在常溫下柿餅7天左右就開始霉變，嚴重影響柿餅品質以及在國際市場中的競爭力。基于此，本研究在霉變柿餅上分離純化霉菌，對主要霉菌采用形態學和分子生物學方法進行鑒定，對主要霉菌的菌學特性進行研究，可為有效控制柿餅霉變和延長貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

小萼子柿柿餅，濰坊臨朐神力有限公司提供。選擇當年自然干燥的小萼子柿餅，發霉后放入無菌樣品袋中，編號備用。其水分含量為41.67%，水分活度為0.876，可溶性糖含量為43.61%，總酸含量為1.17 g/kg，含硫量18.4 mg/kg；霉菌總數為35 cfu/g。

1.2 試驗方法

1.2.1 霉菌的分離、純化與保存 ①菌種分離：在超凈工作臺上，用無菌刀片切取柿餅的發霉部分，切碎，加入90 mL無菌水進行懸浮；28℃、180 r/min下振蕩培養30 min，取懸浮液制成稀釋倍數為101、102、103、104、105、106的稀釋液；取稀釋液1 mL加入滅菌培養皿中，倒入冷卻至50℃左右的孟加拉紅培養基，搖勻，25℃恒溫培養5～7 d[8]。

②菌種純化：采用平板劃線分離法，用接種環以無菌操作挑取含菌樣品在固體培養基表面作有規則劃線，菌株經過多次從點到線的稀釋，最后經培養得到純種單菌落[9]。

③菌種保藏：將純菌株接種于PDA斜面培養基上培養至長滿斜面，4℃保存備用。

1.2.2 霉菌菌株的形態學鑒定 ①點植培養法[14]：從純化菌種平板上挑取單個孢子或菌落，點植于PDA培養基、察氏培養基（CA）和察氏酵母膏培養基（CJA）上等邊三角形三個頂點或中心處，倒置于28℃恒溫箱中培養，每天觀察其生長形態。

②顯微鏡直接觀察法：在載玻片上滴加一滴乳酸苯酚溶液，用接種針挑取菌落，平攤于玻片上，加蓋蓋玻片鏡檢。

1.2.3 霉菌菌株的分子生物學鑒定 ①DNA提取：將所得優勢菌株在PDA培養基上28℃恒溫倒置培養7 d后，通過真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA。

②PCR擴增：擴增使用的上游引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′），下游引物為ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

PCR擴增的反應體系為：50 μL，其中10×buffer 5 μL；Mg2+4 μL；dNTP 4 μL；引物各2 μL；Taq酶2 μL；模板4 μL；雙蒸水補足到50 μL。PCR擴增的反應條件為：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，50℃復性1 min，72℃延伸1 min，30個循環，最后72℃保溫10 min。4℃保存[10，11]。

測序分析：將PCR擴增產物送上海生工進行測序。測序的拼接結果在NCBI上進行BLAST比對，根據比對結果，構建系統發育樹[12]。

1.2.4 主要污染霉菌的生物學特性研究 ① 溫度對霉菌生長的影響：將培養7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌餅[13]，放置于PDA培養基中央，分別在4、20、25、30、35、40℃下培養5～7 d，測定其凈生長直徑。

凈生長直徑（cm）=菌落直徑-0.8

②濕度對霉菌生長的影響：將培養7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌餅，放置于PDA培養基中央，置于環境濕度為50%、60%、70%、80%、90%下，28℃培養5～7 d，觀察生長情況，并測定其凈生長直徑。

③pH值對霉菌生長的影響：將培養7 d左右的霉菌S1、S2利用8 mm打孔器打成菌餅，移到pH值分別為3、5、7、9、11的培養基上，置于28℃下恒溫培養，觀察生長情況，并測定其凈生長直徑。

④霉菌致死溫度和時間測定：將在PDA斜面上培養7d的霉菌制成濃度為106個/mL的孢子懸浮液，取1 mL放入1.5 mL滅菌離心管中，分別置于50、55、60、65、70℃恒溫水浴鍋中處理1、5、10、15、20、25 min后迅速冷卻，之后用吸管取0.1 mL培養液到培養基上，涂平板，28℃下倒置培養，觀察霉菌菌落生長情況。

2 結果與分析

2.1 柿餅污染霉菌的分離

經分離純化，得到7株霉菌。選取其中2株優勢菌株S1和S2進行以下試驗。

2.2 主要霉菌的形態學鑒定

S1在PDA培養基上培養7 d的菌落形態如圖1a、b所示，可見，S1菌落顏色為淡藍綠色，菌落表面有密集的淡黃色液滴，背面為淺黃色；在顯微鏡下觀察的菌株形態如圖1c所示，可見，孢子囊呈掃帚狀。

S2在PDA培養基上的菌落形態如圖2a、b所示，可見，菌落初期為白色，5～7 d后為灰黑色，長而厚，呈棉絮狀；在顯微鏡下觀察的菌株形態如圖2c所示，可見，分生孢子為球形，呈黑褐色。

結合S1和S2在CA培養基和CJA培養基上培養7 d形態觀察以及在顯微鏡下的菌絲形態觀察，初步判定S1為青霉屬，S2為曲霉屬。

2.3 主要霉菌的分子生物學鑒定

2.3.1 DNA提取及PCR擴增 由圖3可知，S1和S2 PCR擴增產物的序列長度均在750 bp左右。

2.3.2 測序結果 測序結果見圖4。

2.3.3 系統發育樹的構建 將PCR產物測序結果在DNAMAN上進行拼接，并將該序列在GenBank上進行BLAST比對，挑選同源性高的基因序列構建系統發育樹（見圖5和圖6），可知，菌株S1與產黃青霉的同源性較高，S2與黑曲霉的同源性較高，結合形態鑒定和生理生化鑒定結果，最終鑒定霉菌S1為產黃青霉，霉菌S2為黑曲霉。

2.4 主要霉菌的生物學特性

2.4.1 溫度對霉菌生長的影響 如圖7所示，霉菌S1產黃青霉和霉菌S2黑曲霉均能在較大的溫度范圍內生長，且S1在25℃下長勢最好，S2在30℃下長勢最好，因此霉菌適宜生長的溫度為25～30℃，且在4℃下幾乎不生長。因此柿餅在冷藏條件下儲藏，可以有效防止霉變；而常溫（20～30℃）則是霉菌滋生的敏感溫度。

2.4.2 濕度對霉菌生長的影響 如圖8所示，霉菌S1產黃青霉和霉菌S2黑曲霉均在濕度大于60%時開始生長，并且隨著濕度增加，霉菌S1和S2的生長速度均顯著增加，因此在柿餅貯藏的過程中要保持通風干燥，使柿餅處于相對濕度較低環境中（60%以下），將有利于防止霉菌的生長繁殖。

2.4.3 pH值對霉菌生長的影響 霉菌對酸堿度不太敏感，一般在pH值3～9都能生長。由圖9可知，霉菌S1產黃青霉適宜生長的pH值范圍是5～7，霉菌S2黑曲霉的最適生長pH值為5，這兩菌株均適宜在酸性條件下生長。

2.4.4 霉菌的熱致死溫度和時間測定 兩種霉菌的耐熱性結果如圖10和圖11所示，霉菌S1產黃青霉和S2黑曲霉在55℃以上均能被致死，并且隨著溫度和時間的增加，致死率顯著增加。霉菌S1產黃青霉在65℃、5 min或70℃、1 min時致死率均能達到100%，霉菌S2黑曲霉在65℃、15 min或70℃、1 min時致死率均達到100%，黑曲霉的耐熱性更強，因此可以使用熱燙的方法在短時間內殺死霉菌。

3 討論與結論

3.1 污染霉菌的分離鑒定

霉菌是導致柿餅成品霉變腐爛的主要原因，大大降低柿餅品質及食用價值，越來越多地引起柿餅加工企業的關注。本研究對柿餅進行霉菌的分離鑒定，最終確認柿餅的主要霉變菌，并研究其菌學特性，有利于控制霉變，從而達到延長柿餅保質期的目的。

由于真菌種類繁多、分布廣泛、形態特征復雜，準確鑒定真菌病原菌是一項復雜而艱巨的工作。此外，由于真菌的形態特征與生理生化指標易隨環境條件的變化而表現出不穩定性，因此傳統的真菌分類和鑒定方法不能準確鑒定到種的水平。鑒于傳統的病原真菌分類和鑒定的局限性，采用擴增真菌rDNA-ITS 進行真菌菌株的鑒定和系統發育研究，已成為植物病原學的研究熱點[15]。崔雨琪等從土壤中分離得到一株產酸能力較高的真菌，經形態學及ITS rDNA基因序列分析鑒定為黑曲霉[16]。田峰等將一株來源于浙貝母新鮮鱗莖的內生真菌菌株FTJZZJ09經ITS rDNA基因序列鑒定為產黃青霉[17]。Luo等對深海中得到的菌株DY-F2利用ITS鑒定，確定為產黃青霉[18]。本研究從發霉柿餅中分離得到兩株主要霉菌污染菌S1和S2，通過形態觀察及ITS rDNA序列對比并構建系統發育樹，最終確定為產黃青霉和黑曲霉，這與王春紅[14]和張曉旭[19]等的研究一致，驗證了前人結論。

3.2 污染霉菌的生物學特性研究

真菌的生長繁殖需要一定條件，主要有營養基質、溫度、濕度、酸堿環境、呼吸環境等，因此，研究分離菌的生長特性，可為控制其生長提供依據。本研究發現，分離出的兩株霉菌在4℃下不生長，所以建議柿餅的貯運和超市銷售溫度條件為0～4℃；兩株霉菌在濕度60%以下幾乎不生長，因此在柿餅的包裝和銷售過程中要保持一個干燥的環境；產黃青霉和黑曲霉的熱致死溫度較低，因此可以在包裝前熱處理殺滅柿餅表面霉菌，但是短時間加熱是否會使其返澀，還有待進一步研究。

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