樹鼩腺病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

宋慶凱，李曉飛，苗雨潤，張志成，王 璇，袁 圓，代解杰，孫曉梅

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實驗樹鼩標(biāo)準(zhǔn)化與應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊，昆明 650118)

樹鼩(Tupaiabelangeri)作為與靈長類動物親緣關(guān)系最近的新型模式動物，在人類疾病模型尤其是感染性疾病模型研究中發(fā)揮著不可或缺的作用，已逐步成為生物醫(yī)學(xué)研究的熱點[1]。前期開展的相關(guān)研究表明，野生來源樹鼩中腺病毒攜帶率較高，并有疑似病例發(fā)生，被列為樹鼩實驗動物微生物質(zhì)量控制的檢測指標(biāo)之一。因此，建立一種高效、快速，可反應(yīng)個體病毒載量的實時熒光定量PCR方法勢在必行。

樹鼩腺病毒(tree shrew adenovirus，TAV)屬于腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬。迄今，已發(fā)現(xiàn)有100多種腺病毒能感染人、哺乳動物和禽類。腺病毒感染會引起急性上呼吸道感染、急性眼結(jié)膜炎、急性出血性膀胱炎、腹瀉等疾病[2]。目前，在樹鼩腺病毒(TAV)檢測方面，已有普通PCR方法報道[3]，但此類方法只可用于TAV定性檢測且靈敏度低。本研究根據(jù)TAV的3’保守區(qū)域設(shè)計特異性引物，通用性好，穩(wěn)定性高，適用于不同型別病毒株檢測，建立了操作簡便、敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可實時定量分析TAV感染程度的TaqMan實時熒光定量PCR方法[4-8]，以期為TAV的分子流行病學(xué)調(diào)查和早期感染研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

野生來源成年樹鼩，性別不限，在普通級環(huán)境設(shè)施中僅飼養(yǎng)了3個月，體重120～150 g。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18℃～28℃，相對濕度30%～60%，噪音≤ 60 dB，光照強(qiáng)度100～150 lx。實驗動物來源于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心[SCXK (滇) K2013-0001]，實驗操作在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所樹鼩種質(zhì)資源中心實驗設(shè)施進(jìn)行[SYXK (滇) K2013-0001]。

1.2 主要試劑與儀器

Viral DNA Kit(購自O(shè)mega)，iTaqTMUniversal Probes One-Step Kit(購自Bio-Rad)。CFX96TM熒光定量PCR儀(Bio-Rad)，核酸蛋白檢測儀，Vortex QL-902，制冷機(jī)(雪科)，臺式微量高速離心機(jī)，恒溫水浴鍋，離心管。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣本來源及DNA提取

樹鼩腺病毒、樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型來自本實驗室保存。使用Viral DNA Kit提取病毒DNA。詳細(xì)操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3.2 TaqMan實時熒光定量PCR的建立

(1)引物設(shè)計合成：從NCBI中檢索獲得TAV的全基因組，利用DNA Star軟件設(shè)計擴(kuò)增病毒株3’保守區(qū)域(22 989 bp～23 476 bp)特異性引物，引物序列為：TAVF：5’-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3’和TAVR：5’-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3’，擴(kuò)增的目的片段為122 bp。根據(jù)測序所得目的基因序列設(shè)計熒光探針引物：5’-Fam-CTCGCCGCCGC CGGTTTCAC-Tamra-3’。委托昆明碩擎生物科技有限公司合成。

(2)陽性標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建：以本實驗室保存的陽性TAV DNA作為模板，進(jìn)行目的基因片段擴(kuò)增。反應(yīng)體系：金牌Mix(green)20 μL，10 μM TAVF 1 μL，10 μM TAVR 1 μL，DNA模板3 μL，終體積25 μL。試劑盒參考退火溫度為55℃～60℃，優(yōu)化后的反應(yīng)條件：98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 15 s，共35個循環(huán)；72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定；膠回收純化；將目的基因片段與PUC57載體進(jìn)行連接；連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞；測序驗證。采用紫外分光光度計測定A260/280數(shù)值，計算質(zhì)粒濃度，將其換算為質(zhì)?？截悢?shù)[每微升拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×(6.02×1023)×(A260/280×10-9)/(DNA堿基數(shù)×660)]，式中，A260/280單位為ng/μL。

(3)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將(2)中的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋至每微升101拷貝。用梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。以每微升108～101拷貝共8個梯度標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)置復(fù)孔及陰性對照。擴(kuò)增體系(20 μL)：2×iTaqTMUniversal Probes One-Step Reaction Mix 10 μL，10 μM TAVF 1 μL，10 μM TAVR 1 μL，10 μM探針引物2 μL，標(biāo)準(zhǔn)DNA模板3 μL，Easy Dilution 3 μL。優(yōu)化后的擴(kuò)增條件為：95℃ 2 min，95℃ 10 s，58℃ 30 s，共40個循環(huán)。通過軟件自動繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)靈敏性檢測：以(3)中梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行TaqMan實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測試驗的靈敏性。

(5)重復(fù)性及特異性檢測：用梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，每個標(biāo)準(zhǔn)品做3個平行管，通過計算Ct均值、變異系數(shù)(即相對標(biāo)準(zhǔn)差：指標(biāo)準(zhǔn)差除以平均值，以百分?jǐn)?shù)表示)分析試驗的重復(fù)性。以樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型、TAV作為樣品，測定TaqMan實時熒光定量PCR特異性。

1.3.3 TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的初步應(yīng)用

采取48份人工飼養(yǎng)3個月野生來源樹鼩糞便，并用Viral DNA Kit提取DNA作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的鑒定

重組質(zhì)粒用PvuII酶切，結(jié)果見圖1A，酶切后獲得兩個片段，長度相加即為質(zhì)粒及插入片段大小。對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增獲得一條約122 bp的特異片段，結(jié)果見圖1B，與預(yù)期擴(kuò)增結(jié)果相符。對目的基因片段進(jìn)行測序分析，NCBI比對結(jié)果同TAV 3’保守區(qū)域(22 989 bp～23 476 bp)序列完全一致，表明目的基因片段已成功接入載體中。

注：從左到右標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)依次為：每微升3.7×101，3.7×102，3.7×103，3.7×104，3.7×105，3.7×106，3.7×107，3.7×108拷貝。圖中“○”代表標(biāo)準(zhǔn)品。圖2 不同稀釋度陽性質(zhì)粒擴(kuò)增形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線Note. The number of copies of the standard from left to right is: 3.7×101, 3.7×102, 3.7×103, 3.7×104, 3.7×105, 3.7×106, 3.7×107, 3.7×108 copies per microliter, respectively. “○”represents standard values.Fig.2 Standard curve of plasmid DNA in different dilutions

注：A：M：1 kb DNA marker，1：酶切后的PUC57重組質(zhì)粒；B：M：500 bp DNA marker，1：重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。圖1 目的片段的擴(kuò)增Note. A: M: 1 kb DNA marker; 1: PUC57 recombinant plasmid after digestion. B: M: 500 bp DNA marker; 1: PCR product of recombinant plasmid.Fig.1 Amplification of target fragment

2.2 TaqMan實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)核酸分析儀檢測結(jié)果：A260/280值為1.93，濃度為50 ng/μL，即拷貝數(shù)為每微升3.7×109拷貝。以10倍梯度稀釋的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，擴(kuò)增效率為95.7%，以起始模板量的對數(shù)值為X軸，循環(huán)數(shù)(Ct值)為Y軸做回歸曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線(Y=-3.430lgX+ 37.951)，具有良好的線性關(guān)系。

2.3 TaqMan實時熒光定量PCR靈敏性

靈敏性檢測試驗擴(kuò)增結(jié)果如圖3，1～8為不同稀釋濃度的陽性質(zhì)粒，當(dāng)陽性質(zhì)?？截悢?shù)為每微升3.7拷貝，才出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線且陰性對照無特異性擴(kuò)增，表明該方法的最低檢測靈敏度可達(dá)每微升3.7拷貝。

2.4 TaqMan實時熒光定量PCR重復(fù)性

分別以每微升3.7×105、3.7×106和3.7×107拷貝的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行擴(kuò)增，每份標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置3個平行管，通過計算Ct值的變異系數(shù)對試驗重復(fù)性進(jìn)行評價，結(jié)果詳見表1，變異系數(shù)不足0.5%。

2.5 TaqMan實時熒光定量PCR特異性

特異性試驗檢測結(jié)果(圖4)顯示，在40個反應(yīng)循環(huán)內(nèi)，以每微升3.7×106拷貝的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和TAV為模板的PCR反應(yīng)有特異性擴(kuò)增曲線。以樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型為模板的PCR反應(yīng)均無擴(kuò)增曲線。表明建立的基于TaqMan探針實時熒光定量PCR方法具有高度特異性。

注：1～8：每微升3.7×107，3.7×106，3.7×105，3.7×104，3.7×103，3.7×102，3.7×101，3.7×100拷貝；9：陰性對照。圖3 TaqMan實時熒光定量PCR靈敏性檢測結(jié)果Note. 1-8: 3.7×107, 3.7×106, 3.7×105, 3.7×104, 3.7×103, 3.7×102, 3.7×101, 3.7×100 copies per μL, respectively; 9: Negative control.Fig.3 Sensitivity of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

每微升拷貝數(shù)CopiespermicroliterCt值 Ctvalue123 平均Ct值A(chǔ)verageofCtvalue變異系數(shù)(%)Coefficientofvariation37×107131813191321131901137×106165316571659165601837×1052001200920112007026

注：圖中“其他病毒”指樹鼩呼腸孤病毒、EV71、人單純皰疹病毒1型。圖4 TaqMan實時熒光定量PCR特異性檢測結(jié)果Note. “Other viruses” in the figure are tree shrew reovirus, EV71, human herpes simplex virus type 1.Fig.4 Specific test results of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

2.6 TaqMan實時熒光定量PCR初步應(yīng)用

如圖5所示，在反應(yīng)的35個循環(huán)內(nèi)，48份樣品中有19份陽性，陽性率為39.58%，最低檢出濃度為每微升3.92拷貝。傳統(tǒng)方法檢測陽性率僅為25%(12/48)。因此，建立的TaqMan實時熒光定量PCR方法更加靈敏且高效，可更好地運(yùn)用于樹鼩腺病毒的檢測，為其防控提供更精準(zhǔn)的檢測方法。

圖5 初步應(yīng)用檢測結(jié)果Fig.5 Preliminary application of the TaqMan real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論

樹鼩腺病毒是無囊膜線性單分子雙股DNA病毒，歸類于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬。在前期飼養(yǎng)觀察中，發(fā)現(xiàn)該病毒可普遍感染樹鼩并引起急性上呼吸道感染、急性眼結(jié)膜炎、急性出血性膀胱炎、腹瀉等多種疾病。Darai等早在1980年報道，在38份樹鼩腎組織培養(yǎng)物中分離獲得1株TAV[9-10]，病毒可凝集大鼠及人“O”型紅細(xì)胞。陳元鼎等[11]1987年報道，在90份成年云南源樹鼩大便中檢測到12份腺病毒陽性，陽性率為3%。吳小閑等[12]1990年報道，從云南野生樹鼩咽拭子、腎細(xì)胞培養(yǎng)物和糞便中分離到10株TAV，并鑒定為2個血清型(TAV-1和TAV-2)。王淑菁等[3]建立了樹鼩腺病毒PCR檢測方法，檢測了56份剛從野外捕獲來源的樹鼩糞便DNA，有24份陽性，檢出的陽性率達(dá)到42.85%，結(jié)果顯示野生樹鼩具有較高的攜帶率。

迄今，在腺病毒檢測方面已有多種方法。其中，間接免疫熒光檢測方法適用于細(xì)胞培養(yǎng)物中TAV的檢測；ELISA檢測方法主要適用于對TAV抗體的篩查，其缺點是檢測結(jié)果假陽性偏高；PCR檢測法具有快速方便、靈敏性好、特異性強(qiáng)等特點，其中實時熒光定量PCR[13-14]方法與傳統(tǒng)PCR方法比較又具有更大的優(yōu)勢，最大的優(yōu)勢是可實時檢測反應(yīng)早期到終點過程中PCR的擴(kuò)增情況，此外還具有靈敏性好、所需樣品少、特異性強(qiáng)、可精確進(jìn)行定量分析等特點，被認(rèn)為是病原學(xué)檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。

本研究根據(jù)TAV的3’保守區(qū)域設(shè)計特異性擴(kuò)增引物[15-17]，采用傳統(tǒng)PCR方法擴(kuò)增目的片段并膠回收純化連接載體，構(gòu)建出重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并探索優(yōu)化反應(yīng)條件及擴(kuò)增體系，成功建立了高效、特異、靈敏性強(qiáng)的TAV TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。重復(fù)性檢測試驗中以3個梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3次重復(fù)，變異系數(shù)檢測結(jié)果均小于0.05%，即試驗重復(fù)性好。采用此方法檢測樹鼩源呼腸孤病毒以及其他引起腹瀉、急性眼結(jié)膜炎等疾病的病毒均無交叉反應(yīng)，表明建立的檢測方法具有良好的特異性。研究中應(yīng)用此方法檢測人工飼養(yǎng)3個月的野生來源樹鼩TAV攜帶情況，檢測結(jié)果顯示，此方法可定性及定量分析不同個體病毒載量情況，靈敏度高，在35個循環(huán)內(nèi)最低檢測限度達(dá)每微升3.92拷貝。陽性檢出率為39.58%，略低于王淑菁等[3]報道的野生源樹鼩病毒檢測結(jié)果，原因可能與樣品來源有關(guān)。

本研究建立的基于TAV的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法具有高效、靈敏度高、特異性和重復(fù)性好的優(yōu)點，既可定性分析又可定量分析[18]。該檢測方法的構(gòu)建為TAV的致病[19]、溶瘤[20]機(jī)理研究提供了詳細(xì)可靠的技術(shù)支持，同時也對TAV防控具有重要作用。

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