孤養(yǎng)對(duì)單次延長應(yīng)激建立的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙模型大鼠行為學(xué)的影響

方錦穎，陳光耀，李龍梅，鄭思思，毛 萌

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)指在經(jīng)歷或目睹重大災(zāi)難性應(yīng)激事件后延遲出現(xiàn)并長期存在的一種精神疾病[1]。作為焦慮障礙的一種，其核心癥狀包括：反復(fù)出現(xiàn)創(chuàng)傷體驗(yàn)，持續(xù)回避創(chuàng)傷事件，警覺性的高度提高和心理的消極變化[2]。單次延長應(yīng)激(single-prolonged stress，SPS)作為通過以疲勞為環(huán)境條件建立的敏感化動(dòng)物模型的一種，較好地模擬了PTSD臨床患者應(yīng)激過程及發(fā)病后的癥狀。較之于其他PTSD動(dòng)物模型，SPS模型重復(fù)性良好，且該模型能夠被抗抑郁及抗焦慮藥物所改善，逐漸成為當(dāng)今研究PTSD最為常用的國際公認(rèn)動(dòng)物模型之一[3]。

對(duì)SPS模型的嘗試改進(jìn)以增加該模型的表觀、預(yù)測和結(jié)構(gòu)效度與臨床的吻合度為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。如Keller等人[4]依據(jù)臨床PTSD發(fā)病率女性高于男性的特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)SPS雌性大鼠模型較之于雄性模型大鼠行為學(xué)條件恐懼行為增加；趙中興、陳旺等人[5-6]采用在大鼠束縛過程中增加不可逃避足底電刺激建立復(fù)合應(yīng)激模型，行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合應(yīng)激組較之于單純SPS組行為學(xué)出現(xiàn)焦慮樣癥狀增加、活動(dòng)性降低、空間記憶受損等特點(diǎn)。孤養(yǎng)作為一種應(yīng)激手段，被應(yīng)用于新生期孤養(yǎng)、慢性不可預(yù)見應(yīng)激等大鼠模型的建立[7-8]。本文擬通過將SPS模型與SPS聯(lián)合孤養(yǎng)模型進(jìn)行對(duì)比，探究孤養(yǎng)對(duì)單次延長應(yīng)激(SPS)建立的創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)模型大鼠的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠36只，體重190～210 g，6周齡，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司[SCXK (京) 2016-0011]，在北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室[SYXK (京) 2016-0038]飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃，濕度(65±5)%，光照12 h，每天更換墊料、飼料及水瓶，自由飲水及進(jìn)食，造模前一周購入進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

75%乙醇，安徽太和縣光明酒精分裝廠，批號(hào)：160606；無水乙醚，北京化工廠，批號(hào)：20170417。圓桶狀透明塑料大鼠固定器：長25 cm，筒口外徑7 cm，內(nèi)徑5 cm，由北京中醫(yī)藥大學(xué)方劑學(xué)教研室提供；曠場箱：底部100 cm×100 cm正方形、高45 cm，材料為灰色木質(zhì)，箱底部用黑線劃分出25個(gè)正方形格(20 cm×20 cm)，攝像頭位于曠場箱正中格上方；造模及強(qiáng)迫游泳使用水箱：底部65 cm×100 cm、高80 cm的立方形紅色塑料水箱；行為學(xué)觀察及自動(dòng)分析系統(tǒng)：Nodule公司生產(chǎn)，包括計(jì)算機(jī)、攝像監(jiān)控系統(tǒng)、Observior及Ethevision行為學(xué)分析軟件。曠場箱、水箱和行為學(xué)觀察及自動(dòng)分析系統(tǒng)由北京中醫(yī)藥大學(xué)診斷系神經(jīng)免疫實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及造模

將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)分為3組，即正常組、SPS模型組、SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組，每組各12只，經(jīng)檢測各組大鼠體重在同一基線水平上。正常組不予處理，SPS模型組與SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組進(jìn)行SPS造模，流程如下：使用束縛桶將大鼠進(jìn)行2 h束縛，隨后置于水深45 cm、水溫25℃的水箱中進(jìn)行20 min的游泳，游泳結(jié)束15 min后將大鼠置于密閉玻璃容器中使用乙醚進(jìn)行麻醉，失去意識(shí)后置于籠子中放置在通風(fēng)處，待意識(shí)恢復(fù)后進(jìn)行靜養(yǎng)[9]。造模后正常組、SPS模型組每籠6只進(jìn)行飼養(yǎng)，孤養(yǎng)組每籠1只，大鼠均放置于普通飼養(yǎng)籠中進(jìn)行飼養(yǎng)。除更換墊料、飼料及飲水外，避免打擾大鼠，連續(xù)飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行行為學(xué)檢測。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測

(1)大鼠體重增長數(shù)：在造模前及行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分別使用電子秤測量大鼠體重，后一次體重減去前一次體重即為大鼠體重增長數(shù)。

(2)曠場實(shí)驗(yàn)[10-11]：實(shí)驗(yàn)者穿著純黑色衣服(避免軟件分析時(shí)實(shí)驗(yàn)者身體某些淺色部位被識(shí)別為大鼠)將動(dòng)物放入箱內(nèi)的正中格，迅速將進(jìn)入曠場區(qū)域的手撤出，開始進(jìn)行錄像5 min，錄像過程中實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)遠(yuǎn)離曠場箱以避免對(duì)動(dòng)物造成干擾。每只動(dòng)物測試結(jié)束后用蘸有酒精的毛巾擦拭曠場箱內(nèi)部，以避免對(duì)下只動(dòng)物的測試造成影響。錄像結(jié)束后采用軟件對(duì)錄像進(jìn)行分析，測得每組大鼠5 min內(nèi)運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)以及單次最大運(yùn)動(dòng)距離。

(3)僵立行為測試[12]

使用造模時(shí)水箱，將水注入箱中(調(diào)節(jié)使水深45 cm、水溫25℃)，將大鼠小心放置于水箱中。僵立時(shí)間的記錄標(biāo)準(zhǔn)為大鼠在水中靜止不動(dòng)，但可以有輕度搖擺，除保持呼吸運(yùn)動(dòng)外其他的肌肉活動(dòng)均消失。記錄5 min內(nèi)大鼠僵立時(shí)間及次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重增長數(shù)

SPS模型組大鼠體重增長數(shù)(28.3±4.9)g較正常組(34.8±4.8)g降低，差異有顯著性(P< 0.01)，SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組(30.0±4.8)g較之于正常組大鼠體重增長數(shù)降低，差異有顯著性(P< 0.05)，SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組差異無顯著性(P> 0.05)。

2.2 大鼠曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動(dòng)距離

SPS模型組較正常組運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)減少，差異有顯著性(P< 0.05)，單次最大運(yùn)動(dòng)距離減少，差異有顯著性(P< 0.01)；SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于正常組運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動(dòng)距離差異無顯著性(P> 0.05)；SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動(dòng)距離增加，差異有顯著性(P< 0.05)。見表1。

2.3 大鼠僵立行為次數(shù)及時(shí)間

SPS模型組較正常組僵立行為次數(shù)、僵立時(shí)間增加，差異有顯著性(P< 0.01)；SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于正常組僵立行為次數(shù)、僵立時(shí)間增加，差異有顯著性(P< 0.05)；SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組僵立行為次數(shù)、僵立時(shí)間差異無顯著性(P> 0.05)。見表2。

3 討論

應(yīng)激能夠造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)及消化系統(tǒng)功能紊亂，從而出現(xiàn)體重增長速度較前減少[13]。曠場實(shí)驗(yàn)通過觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新異環(huán)境中的自主行為、探究行為與緊張度，從而反映出大鼠的焦慮水平[14]。僵立行為測試將大鼠重新置于造模時(shí)場景，當(dāng)大鼠重新受到負(fù)性刺激后表現(xiàn)出的恐懼反應(yīng)，是檢測SPS模型是否成功復(fù)制的重要指標(biāo)。造模7 d后SPS模型組較之于正常組，大鼠體重增長數(shù)減少，曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動(dòng)距離均減少，僵立行為測試僵立次數(shù)及時(shí)間增加，與之前文獻(xiàn)記載相符，提示對(duì)SPS模型進(jìn)行了成功復(fù)制[15]。

在精神類疾病動(dòng)物模型的制作中，孤養(yǎng)作為一種負(fù)性情緒刺激被作為應(yīng)激源廣泛應(yīng)用。在本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，預(yù)期將孤養(yǎng)作為一種額外應(yīng)激刺激附加于SPS模型，從而使SPS模型更加穩(wěn)定以及PTSD相關(guān)表現(xiàn)更加明顯。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組造模7 d后較之于SPS模型組曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動(dòng)總距離、穿格次數(shù)、單次最大運(yùn)動(dòng)距離增加，提示SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組較之于SPS模型組焦慮水平降低。結(jié)果表明7 d孤養(yǎng)使得SPS模型焦慮狀態(tài)得到改善，與預(yù)期結(jié)論截然相反。

Tab.1Total movement distance, frequency of grid crossing and single maximum movement distance of the rats in each group during the open field test

組別Groups運(yùn)動(dòng)總距離(cm)Totalmovementdistance穿格次數(shù)Frequencyofgridcrossing單次最大運(yùn)動(dòng)距離(cm)Singlemaximummovementdistance正常組Normalgroup22029±5349862±290113±36SPS模型組SPSmodelgroup15099±7514a547±368a73±24bSPS聯(lián)合孤養(yǎng)組SPScombinedwithsocialisolationgroup24066±7475cd958±342cd105±29cd

注：與正常組比較，aP< 0.05，bP< 0.01，cP> 0.05；與SPS模型組比較，dP< 0.05。

Note. Compared with the normal group,aP< 0.05,bP< 0.01,cP> 0.05. Compared with the SPS model group,dP< 0.05.

Tab.2Freezing frequency and time of the rats in each group

組別Groups僵立次數(shù)Freezingtimes僵立時(shí)間(s)Freezingtimeduration正常組Normalgroup083±111075±101SPS模型組SPSmodelgroup775±742a652±530aSPS聯(lián)合孤養(yǎng)組SPScombinedwithsocialisolategroup442±438bc351±369bc

注：與正常組比較，aP< 0.01，bP< 0.05；與SPS模型組比較，cP> 0.05。

Note. Compared with the normal group,aP< 0.01,bP< 0.05. Compared with the SPS model group,cP> 0.05.

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)患者在遭受巨大應(yīng)激過后，當(dāng)再次出現(xiàn)與應(yīng)激相關(guān)聯(lián)或類似的事件、情景或其他線索時(shí)，常表現(xiàn)出強(qiáng)烈的心理與生理反應(yīng)。為避免這種反應(yīng)的出現(xiàn)，患者往往出現(xiàn)持續(xù)回避的系列癥狀，包括與他人避免接觸及獨(dú)自生活于安靜的環(huán)境中，提示回避可能是PTSD患者的一種自我保護(hù)性反應(yīng)，將大鼠單獨(dú)進(jìn)行飼養(yǎng)從一定程度上滿足了PTSD大鼠進(jìn)行回避的需求[16]。在實(shí)驗(yàn)過程中亦發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷巨大應(yīng)激過后，大鼠常處于易激惹狀態(tài)，在群居過程中更容易出現(xiàn)打斗，因此群居飼養(yǎng)可能會(huì)對(duì)大鼠造成額外的應(yīng)激。在動(dòng)物模型的制作中，將孤養(yǎng)作為應(yīng)激源進(jìn)行造模多采用較長時(shí)間的干預(yù)，本研究僅僅對(duì)SPS造模后孤養(yǎng)7 d的大鼠進(jìn)行觀察，造模7 d后SPS聯(lián)合孤養(yǎng)組焦慮水平較之于SPS模型組降低，提示在SPS造模后進(jìn)行7 d孤養(yǎng)可能作為一種保護(hù)機(jī)制作用于模型大鼠，而進(jìn)一步延長孤養(yǎng)時(shí)間是否會(huì)對(duì)SPS模型造成負(fù)性機(jī)制尚不得而知。因此，課題組進(jìn)一步將對(duì)SPS聯(lián)合孤養(yǎng)模型多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的行為學(xué)改變進(jìn)行觀察，以明確孤養(yǎng)對(duì)SPS模型影響的具體時(shí)間點(diǎn)，并進(jìn)一步探究其相關(guān)病理及分子機(jī)制。

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