廣西黑山羊溶血性曼氏桿菌分離鑒定

黃宇何宏勇李軍劉香林梁清甘一波唐第深吳翠蘭潘艷*

（1，廣西玉林市動物疫病預防控制中心 537000；2，廣西獸醫研究所 530001；3，廣西獸醫生物技術重點實驗室 530001）

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia Haemolytica）為微溶于血、革蘭氏陰性球桿菌、曼氏桿菌屬的成員。溶血性曼氏桿菌是危害牛羊等反芻動物的病原之一，比其他曼氏桿菌屬成員包含肉芽曼氏桿菌、葡萄糖苷酶曼氏桿菌、反芻獸曼氏桿菌、多源曼氏桿菌的致病性強[1]。國內外已有很多研究報道，當牛羊感染該菌時經濟損失非常慘重，由于其可引起牛羊肺炎及新生羔羊的敗血癥。現本試驗運用細菌的分離技術、生化鑒定試驗和16SrRNA序列分析，從黑山羊的肺臟中分離出1株溶血性曼氏桿菌，并進行藥物敏感性試驗，旨在為羊病的防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2017年6月，廣西某黑山羊養殖戶在當地購買一批黑山羊，該羊群曾在田間地頭放牧。購買15d后，患病羊開始出現咳嗽、流鼻涕、發熱等癥狀。該養殖戶給黑山羊使用氟苯尼考等藥物，但不見好轉。于是養殖戶將該病死羊送廣西獸醫研究所就診。該羊體毛粗糙、無光澤，體形偏瘦。剖檢時見胸、腹腔有積水，肝、脾、腎均無肉眼可見病變，肺有出血。

1.2 主要試劑

細菌DNA提取試劑盒、2×Taq MasterMix、DH5α等均購自北京康為世紀生物科技有限公司；PCR儀購自北京天根生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯（TSA）購自北京路橋技術有限責任公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 細菌分離

無菌采取黑山羊肺臟在TSA板進行接種，37℃培養24h后挑取單個菌落進行純培養，再挑取純化后的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。

1.4 生化鑒定

將純化的菌落按照常規方法37℃培養在生化鑒定管中，觀察細菌的生理生化特性。

1.5 16SrRNA基因擴增

用細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA，其操作步驟按照說明書進行。然后以此DNA為模板、細菌16SrRNA通用型引物[2]進行PCR擴增。其擴增程序為先進行95℃5 min；然后進行30個循環95℃30s、52℃40s、 72℃50min； 最后再進行72℃10min。擴增結束后，取7μl的PCR產物在1.5%的凝膠瓊脂糖上進行電泳，觀察電泳結果。

1.6 序列分析

將PCR產物進行回收、克隆、測序。所得的測序結果用生物學軟件MegAlign和Mega 7進行分析，并分別作出同源性分析圖和繪制進化樹圖。

1.7 gcp基因擴增

以細菌DNA為模板、以gcp基因為目的基因，根據廣西獸醫研究所建立檢測溶血性曼氏桿菌的PCR方法進行特異性擴增。

1.8 動物致病性試驗

分別將10只健康的昆明鼠隨機分成2組（試驗組和對照組），試驗組每只小鼠腹腔注射細菌純培養物0.4ml，另一組每只小鼠注射0.4ml的生理鹽水作為對照組，觀察小鼠的身體狀況，并記錄結果。

1.9 藥物敏感性試驗

取100μl純培養的細菌均勻涂在TSA板上，然后貼上藥敏片，再置于37℃培養24h，觀察抑菌效果。

2 試驗結果

2.1 細菌分離

細菌在TSA板上生長良好，鏡檢結果為革蘭氏陰性的小桿菌。

2.2 生化鑒定

生化試驗結果顯示陽性結果的有葡萄糖、氧化酶、甘露醇、山梨醇、木糖和麥芽糖；陰性結果有山梨糖、海藻糖、甘露糖和脲酶。這些結果與陸承平 《獸醫微生物學》（第三版）[3]的溶血性曼氏桿菌相符合，初步判斷該分離株為溶血性曼氏桿菌。

2.3 16SrRNA基因擴增結果

擴增結果見圖1，獲得了1500bp條帶大小的目的片段，并命名為MS-1706。

圖1 分離株16SrRNA基因擴增電泳圖

2.4 16SrRNA測序結果分析

將測序結果與10株溶血性曼氏桿菌參考株進行同源性比較，結果與參考株的同源性為94.5%-100%。在進化樹上，分離株MS-1706與參考株NCTC 9380(M75080)、8-3365-5(KLJ051693)等都在同一分支上。說明MS-1706分離株為溶血性曼氏桿菌。

2.5 gcp基因擴增

根據廣西獸醫研究所建立檢測溶血性曼氏桿菌的PCR方法進行檢測該細菌，擴增得到與預期大小的片段，如圖2。

圖2 分離株gcp基因擴增電泳圖

2.6 致病性試驗結果

試驗組小鼠在注射后6h開始出現行動緩慢，在24h內已有80%的小鼠出現死亡。對死亡小鼠進行剖解，發現肺有出血點。同時，從小鼠肺中分離到該菌。

2.7 藥物敏感性試驗結果

本試驗共用14種藥物做藥物敏感性試驗，結果分離菌對藥物頭孢噻肟、強力霉素、恩諾沙星和頭孢曲松呈現出高度敏感；對鏈霉素、慶大霉素、阿莫西林、阿奇霉素和四環素表現為中敏；對復方新諾明、多粘菌素B、卡那霉素、青霉素G和氨芐西林表現為耐藥。

3 討論

溶血性曼氏桿菌大多數是從肺臟中分離的，少部分從鼻拭子中分離。本研究從廣西某養殖戶病死黑山羊的肺臟中分離出一株菌。通過傳統的方法包含細菌的形態特征鑒定技術、生理生化特性初步鑒定該菌為溶血性曼氏桿菌。再結合新型技術PCR的方法對16SrRNA基因進行擴增和序列分析以及應用廣西獸醫研究所建立的溶血性曼氏桿菌的診斷方法進行檢測，進一步確定該菌（MS-1706）即是溶血性曼氏桿菌。馮旭飛等[4]研究報道表明，傳統方法不僅費時費力，且該菌的分離率較低，較難分離得到該菌。Shangthalingam等[5]報道在2009～2010年間對溶血性曼氏桿菌進行病原學分離和PCR檢測，結果病原的分離率僅為3%，而PCR檢測率占77%。因此，在做病原學診斷時，應注意傳統方法和新型方法的結合。

16SrRNA即16Sribosomal RNA，是原核核糖體30S小亞基的組成部分。16SrRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在與所有細菌的基因組中。該基因具有高度保守性和特異性，該基因檢測技術已成為檢測和鑒定病原菌有效手段。基于16SrRNA基因序列核苷酸同源性分析顯示，分離株MS-1706與10株溶血性曼氏桿菌參考株的核苷酸同源性為94.5～100%，顯示較高的同源性。為更進一步了解分離株MS-1706的分子特征，本研究對其16SrRNA基因繪制核苷酸進化樹，進化樹分析顯示，分離株與溶血性曼氏桿菌參考株出在同一分支，且與溶血性曼氏桿菌參考株NCTC 9380(M75080)、8-3365-5(KLJ051693)的親緣關系較近。原名為溶血性曼氏桿菌的細菌是一個復雜的類群，按生化特性可分為A生物型和T生物型，現將A生物型劃分為溶血性曼氏桿菌。據Lee[6]報道，A生物型含有gcp基因，而T生物型沒有此基因，通過運用廣西獸醫研究所以gcp為靶基因建立的PCR診斷方法擴增到相應的目的片段。由上述可知，該分離株為溶血性曼氏桿菌。

本研究通過致病性試驗表明該菌具有很強的致病性。溶血性曼氏桿菌具有多種毒力因子，包含白細胞介素、脂多糖、脂多糖、白細胞介素等，而該菌是怎樣引起患畜致病的機理還有待于進一步的研究。溶血性曼氏桿菌病的發生已呈全球分布，引起人們廣泛關注。馬增軍等[7]在河北從病死綿羊的肺臟、心血等臟器分離出5株溶血性曼氏桿菌；李璞君等[8]從四川死亡山羊的肺組織中分離到1株該菌；王羽等[9]運用形態學鑒定、生化試驗和PCR等方法從江蘇羊肺中分出1株該菌；李雪霞等[10]從云南奴比山羊羊肺中分離出1株溶血性曼氏桿菌。因此，對于該病的治療原則是盡早發現，及時治療，否則該病易與其他病原菌如多殺巴氏桿菌、化膿性隱秘桿菌、綿羊肺炎支原體等混合感染而加大治療難度。

對于溶血性曼氏桿菌病，應用傳統的藥物治療是預防和治療該病最主要的手段。Lubbers[11]、Katsuda[12]等研究表明，該菌已經對氨基糖苷類、四環素類、磺胺類等藥物已產生一定程度的耐藥。本次研究表明，分離菌MS-1706對藥物頭孢噻肟、強力霉素、恩諾沙星和頭孢曲松這4種呈現出高度敏感；對鏈霉素等5種藥物表現為中敏；對復方新諾明等5種藥物表現為耐藥，說明該菌對藥物出現多重耐藥。關于該菌產生的耐藥機制研究的較少，還有待于更進一步的研究。綜上所述，臨床上如何選擇有效用藥是治療本病的關鍵。本研究為羊溶血性曼氏桿菌病的治療提供理論基礎。

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[5]Shanthalingam S,Goldy A,Bavanan thasivam J,et al.PCR assay detectsMannheim ia haemolytica in culture-negative pneumonic lung tissuesof bigborn sheep(Ovis canadensis)from outbreaks in the western USA,2009-2010[J].JW ildl Dis,2014,50(1):1-10.

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[9]王羽,董文龍,汪艷,等.綿羊溶血性曼氏桿菌分離鑒定[J].中國獸醫科學,2016,46(7):870-873.

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