紫娟茶花青素的抗氧化活性及穩定性

王 燕,馮 瑛,楊曉萍,李 潔,董昕陽,曾維超

(華中農業大學園藝林學學院茶學系,湖北省果茶辦公室,湖北武漢 430070)

紫娟由云南大葉群體國家級茶樹良種——勐海大葉種中單株培育而成[1],是云南大葉群體種中的一種珍稀優良品種。紫娟茶內黃酮類、咖啡堿、鋅和表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯(EGCG3″Me)等物質的含量較高[2-3],且以花青素含量最為突出,其是使紫娟茶樹莖、芽、葉及由其鮮葉加工而成的炒青綠茶茶湯湯色均為紫色的主要原因。研究表明紫娟茶具有很強的抗氧化活性、顯著的降血壓效果以及抗癌、降血糖、保護肝臟、提高記憶力等[2]功能,紫娟茶花青素在這些功能的發揮中起著重要作用。

花青素屬于類黃酮化合物,是一類廣泛存在于植物中的天然水溶性色素,因其具有較強的抗氧化活性而在食品、藥品、化妝品等領域有廣闊的應用前景[4]。國內外關于植物中花青素的研究主要集中于提純、結構鑒定及活性方面的研究[5-7],花青素因分子結構中含有多個酚羥基導致其穩定性相對較差,已有研究表明，由紫薯、藍莓中提取的花青素在加工及貯藏過程中，易受外界環境因素的影響而導致其色澤改變、活性降低,這制約了花青素的應用及相關產品開發[8-9]。然而,目前國內外有關紫娟茶花青素的研究主要以提取、純化為主,對于紫娟茶花青素的抗氧化活性的研究則相對較少,而關于其穩定性的研究尚未見詳細報道。

為科學利用紫娟茶資源,有必要對紫娟茶花青素的相關研究進行進一步完善,本研究以紫娟茶花青素為研究對象,采用FRAP法、ABTS法和DPPH法測定其抗氧化能力,并以紫娟茶花青素的保存率為考察指標,探討貯藏條件對其穩定性的影響,從而為紫娟茶花青素的貯藏及應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫娟茶鮮葉 采自華中農業大學教學茶園品種園的紫娟品種茶1芽4、5葉;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ,純度≥99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH,生物試劑)、2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,純度≥98%) 上海源葉生物科技有限公司;濃鹽酸 分析純,信陽市化學試劑廠;氯化鉀、三氯化鐵、硫酸鎂、硫酸銅、氯化鈣、氯化鋁、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、30%過氧化氫、乙酸、乙酸鈉、硫酸亞鐵、抗壞血酸等 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

SY-360型超聲波提取器 上海寧商超聲儀器有限公司;DELTA-320型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-2450型紫外可見分光光度計 島津企業管理有限公司;LRH-250A型生化培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司;LPS-1055D型真空冷凍干燥機 無錫萊浦儀器設備有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫娟茶花青素的制備 按蒸青固樣法[10]制備紫娟茶干樣,磨碎,過40目篩,4 ℃冷藏備用。采用預實驗優化出的紫娟茶花青素最佳提取工藝制備花青素,具體步驟為:稱取1.0 g茶粉,置于50 mL離心管中,以1∶30的料液比加入含2%鹽酸的90%乙醇溶液,將離心管置于超聲波提取器中，于60 ℃、功率100 W條件下，浸提40 min后,取出離心管，在4200 r/min離心10 min,取上清液。茶渣進行第二次提取,合并兩次上清液,經減壓濃縮,-50 ℃凍干,4 ℃貯存備用。

1.2.2 紫娟茶花青素抗氧化活性的測定 分別稱取一定量的花青素凍干粉及VC,用超純水溶解,使兩溶液濃度均為1 mg/mL,稀釋至適當濃度,用于總抗氧化能力及清除ABTS+·和DPPH·的能力。總抗氧化能力的測定參考Benzie等[11]采用的鐵離子還原抗氧化劑能力法(FRAP)進行,樣品的FRAP值以FeSO4當量濃度(mmol/L)表示;清除ABTS+·能力的測定參考Re等[12]和Thaipong等[13]的測定方法進行,結果以ABTS+·清除率來表示;清除DPPH·能力的測定參考Blois[14]的測定方法進行,結果以DPPH·清除率來表示。

1.2.3 紫娟茶花青素穩定性研究

1.2.3.1 pH對紫娟茶花青素穩定性的影響 分別以0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調節花青素溶液的pH至1.0～12.0,pH用pH計測定,溶液靜置1 h后,觀察溶液顏色，并于390～710 nm進行光譜掃描。

1.2.3.2 溫度對紫娟茶花青素穩定性的影響 將花青素溶液分別于4、25、40、60、80、100 ℃水浴恒溫保存7 h,每隔1 h取樣，用于花青素保存率測定。

1.2.3.3 貯藏時間、光照對紫娟茶花青素穩定性的影響 將花青素溶液分別在4 ℃光照/避光、25 ℃光照/避光環境中貯藏21 d,每隔2 d取樣，用于花青素保存率測定。

1.2.3.4 H2O2、Na2SO3對紫娟茶花青素穩定性的影響 分別向紫娟茶花青素溶液中以1∶9(v∶v)的比例添加濃度為0.05%、0.5%、1%的H2O2溶液;分別向紫娟茶花青素溶液中以1∶9(v∶v)的比例添加濃度為0.05%、0.1%、0.25%的Na2SO3溶液濃度。上述兩種方式處理的溶液分別于室溫下放置100 min,每隔20 min取樣，用于花青素保存率測定。

1.2.3.5 金屬離子對紫娟茶花青素穩定性的影響 分別向花青素溶液中以1∶9 (v∶v)的比例添加濃度均為0.1 mol/L的Fe3+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Al3+溶液,在放置1 h和6 h時取樣，用于花青素保存率測定。

1.2.4 花青素的保存率測定 采用單一pH法測定樣品溶液花青素含量[15],根據處理前后花青素含量差異計算花青素的保存率[16]。

花青素保存率(%)=處理后花青素含量/初始花青素含量×100

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 紫娟茶花青素的抗氧化活性

由表1結果可知,在一定濃度范圍內,紫娟茶花青素的總抗氧化能力、ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力均與花青素濃度呈顯著正相關,決定系數分別為0.9991、0.9952和0.9926。當FRAP值為0.5 mmol/L時,所需花青素和VC的濃度分別為0.39和19.30 μg/mL;花青素與VC對ABTS+·和DPPH·清除能力的IC50分別為0.76和0.13,40.82和13.46 μg/mL,表明紫娟茶花青素的抗氧化活性顯著強于VC。

表1 紫娟茶花青素的抗氧化活性Table 1 The antioxidant activity of anthocyaninsfrom Zijuan Tea

研究報道，當茶多酚與VC的FRAP值相當時,所需茶多酚的濃度高于VC[17],而當紫娟茶花青素與VC的總抗氧化能力相當時,所需花青素的濃度僅為VC濃度的1/50。當清除50%的ABTS+·和DPPH·時,所需茶多酚濃度分別是VC濃度的2/3、1/2[18],而當清除50%的ABTS+·和DPPH·時,所需紫娟茶花青素的濃度分別僅為VC濃度的1/54、1/90,由此可見,紫娟茶花青素的抗氧化活性比茶多酚強。不僅如此,紫娟茶花青素的抗氧化活性也比報道的藍莓花青素強,如張楊等[19]研究表明，清除50%的ABTS+·和DPPH·所需藍莓花青素濃度分別是VC的1/4和1/3。紫娟茶中含有豐富的花青素和茶多酚,按照本方法提取的紫娟茶花青素中不可避免地含有一些茶多酚,紫娟茶花青素具有較強的抗氧化活性，可能是由于其所含的花青素與茶多酚協調作用的結果。

2.2 紫娟茶花青素的穩定性

2.2.1 pH對紫娟茶花青素穩定性的影響 由表2可知,pH顯著影響紫娟茶花青素溶液的顏色。當pH≤5.0時,溶液以紅色為主;pH≥6.0時,溶液開始向綠色轉變,且隨著pH增大，綠色逐漸加深直至為墨綠色;pH≥7.0時,溶液中開始出現少量沉淀,且隨著pH增大，沉淀逐漸增多。

表2 pH對花青素溶液顏色的影響Table 2 Effect of pH on the color of anthocyanins

由圖1可知,pH≤6.0時,溶液的吸收光譜基本無明顯變化,均于440 nm附近出現最大吸收峰,其中pH1.0時，溶液在530 nm附近出現花青素的特征吸收峰,這證明提取出的溶液為花青素溶液[20];pH≥7.0時,溶液的吸收光譜發生明顯變化,440 nm附近的吸收峰消失,490 nm附近出現新的吸收峰。因此,紫娟茶花青素在酸性條件下較穩定。

圖1 花青素溶液在不同pH條件下的吸收光譜圖Fig.1 Absorption spectra of anthocyanins solution under different pH conditions

2.2.2 溫度對紫娟茶花青素穩定性的影響 由圖2可知,溫度越高,紫娟茶花青素的保存率越低,說明溫度顯著影響紫娟茶花青素的穩定性(p<0.05);在不同溫度下保存紫娟茶花青素,其保存率均隨保存時間的延長而逐漸降低,且溫度越高,降低幅度越大。紫娟茶花青素在不同溫度保存7 h后,4和25 ℃下的保存率為97%和84%,而40、60、80和100 ℃下的保存率已分別降至56%、50%、40%和36%。由此可見,紫娟茶花青素的熱穩定性較差,應于低溫環境中保存。

圖2 溫度對花青素穩定性的影響Fig.2 Effects of temperature on the stability of anthocyanins注:不同字母表示同一時間不同溫度處理的花青素保存率差異顯著(p<0.05)。

2.2.3 貯藏時間、光照對紫娟茶花青素穩定性的影響 由圖3可知,隨貯藏時間的延長,紫娟茶花青素的保存率逐漸降低,且貯藏溫度越高,其保存率越低。貯藏21 d后,紫娟茶花青素4 ℃時的保存率為70%(光照)、73%(避光),而25 ℃時的保存率僅為33%(光照)、47%(避光)。這表明貯藏時間顯著影響紫娟茶花青素的穩定性(p<0.05),紫娟茶花青素不宜長時間放置。

圖3 貯藏時間、光照對花青素穩定性的影響Fig.3 Effects of storage time and illumination on the stability of anthocyanins注:不同小寫字母表示避光與光照處理的花青素保存率差異顯著(p<0.05);不同大寫字母表示同一避光或光照條件下不同時間的花青素保存率差異顯著(p<0.05)。

光照也明顯影響紫娟茶花青素的穩定性。紫娟茶花青素于4 ℃貯藏時,避光與光照條件下貯藏5 d,其保存率差異不顯著;但當貯藏7 d及以上時,避光條件下的保存率均顯著高于光照條件下的保存率(p<0.05)。紫娟茶花青素于25 ℃貯藏,貯藏1 d及以上時,避光條件下的保存率均顯著高于光照條件。上述結果表明，紫娟茶花青素在光照條件下的穩定性較差,應貯藏在低溫、避光環境中。

2.2.4 H2O2、Na2SO3對紫娟茶花青素穩定性的影響 由圖4可知,H2O2和Na2SO3處理均顯著影響紫娟茶花青素的保存率(p<0.05);且H2O2和Na2SO3的濃度越大,處理時間越長,紫娟茶花青素的保存率越低,溶液的顏色逐漸變淺。由此可見,氧化劑、還原劑均顯著影響紫娟茶花青素的穩定性,故加工、貯藏時應盡量避免其與氧化劑、還原劑接觸。

圖4 H2O2和Na2SO3對花青素穩定性的影響Fig.4 Effects of H2O2 and Na2SO3on the stability of anthocyanins注:不同字母表示同一時間不同濃度的氧化劑、還原劑處理的花青素保存率差異顯著(p<0.05)。

2.2.5 金屬離子對紫娟茶花青素穩定性的影響 由圖5可知,0.1 mol/L的Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+均顯著影響紫娟茶花青素的保存率(p<0.05),其中,Fe3+和Cu2+對花青素保存率的影響程度最大,放置1 h的花青素保存率已分別降至37%、44%,放置6 h的花青素保存率則分別降至13%、28%,溶液顏色由深紅色分別變為黃綠色、灰綠色,且均伴有絮狀沉淀產生。Mg2+、Ca2+和Al3+對花青素保存率的影響程度相對較小,放置1 h的花青素保存率均在84%以上,放置6 h的花青素保存率均在74%以上,溶液顏色均保持為深紅色。由此可見,紫娟茶花青素在提取、加工時應盡量使用去離子水,貯藏時應盡量避免與鐵質、銅制器皿接觸,以防Fe3+、Cu2+等溶出而影響花青素的穩定性。

圖5 金屬離子對花青素穩定性的影響Fig.5 Effects of metal ions on the stability of anthocyanins注:不同字母a～f表示放置1 h時不同金屬離子處理的花青素保存率差異顯著(p<0.05),g～l表示放置6 h時不同金屬離子處理的花青素保存率差異顯著(p<0.05)。

3 結論

在供試濃度范圍內,紫娟茶花青素的總抗氧化能力、清除ABTS+·和DPPH·的能力均與花青素濃度呈正相關,且均強于VC。pH、溫度、光照、貯藏時間、H2O2、Na2SO3及金屬離子(Fe3+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+)均顯著影響紫娟茶花青素的穩定性,進而會影響其抗氧化活性的發揮。

為了延緩紫娟茶花青素抗氧化活性的減弱,提高其在保健食品、藥品、化妝品等領域中的應用價值,紫娟茶花青素宜于酸性、低溫、避光的環境中加工、貯藏,且不宜時間過長,盡量避免接觸氧化劑、還原劑及Fe3+、Cu2+等金屬離子。