有機磷農藥廢水高效降解菌的篩選及菌群構建

李鐵軍　丁邦琴　周春曉

摘要：利用有機磷農藥廢水培養基，從江蘇省南通市有機磷農藥生產企業污水處理池活性污泥中馴化、分離了52株具有有機磷農藥廢水降解能力的菌種，建立資源庫。對菌種資源庫進行高效有機磷農藥廢水降解菌的篩選，獲得14株72 h COD去除率大于60%的菌株。經形態學觀察和16S rDNA初步鑒定，10株細菌分屬于假單胞菌屬（Pesudomonas）、不動菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、副球菌屬（Paracoccus）；4株真菌分屬于絲孢酵母屬（Trichosporon）、曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Piniciellum）。選擇降解率高的5株菌進行組合培養，篩選了6組72 h COD去除率大于70%的高效降解有機磷農藥廢水的菌群組合。

關鍵詞：有機磷農藥廢水；高效降解菌；菌群組合；篩選

中圖分類號：X592 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）03-0019-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.03.005

Abstract： Based on medium made of organic phosphorus pesticide wastewater，a resource library contains 52 strains with degrading ability of organophosphorus pesticide wastewater was set up， these strains were domesticated and isolated from activated sludge from sewage treatment tank of organophosphorus pesticide production enterprises in Nantong city，Jiangsu province. 14 strains with 72 h COD removal rate more than 60% were obtained by screening of highly efficient degradation strain from the library. Through morphological observation and 16S rDNA identification，10 strains of bacteria belong to Pseudomonas，Acinetobacter，Bacillus，and the genus Paracoccus，and 4 fungi were classified as Trichosporon，Aspergillus，Trichoderma and Penicillium. Finally，6 group of flora combination with 72 h COD removal rate more than 70% were selected by using 5 strains with high degradation rate.

Key words： organophosphorus pesticide wastewater； highly efficient degradation strain； flora combination； screening

有機磷農藥是目前應用最廣泛的農藥，具有高效、經濟、方便和廣譜等優點。然而，有機磷農藥生產和使用過程中產生的廢水具有濃度高、毒性大、成分復雜等特點，如不進行有效處理， 將會嚴重破壞生態環境[1]。生物降解法是處理有機磷農藥廢水的有效方法之一，與傳統的理化處理方法相比，具有節能減排、針對性強、無需增加設備、環保等優點[2]。生物降解法的原理是利用微生物的代謝將有機磷農藥廢水同化或分解，其核心是高效降解菌的篩選[3]。

近年來，國內外研究學者已報道分離的有機磷農藥廢水降解菌幾乎包括細菌、真菌、放線菌、藻類等各種微生物，其中，細菌由于其生化上的多種適應能力以及易誘發突變菌株，在降解微生物中占重要地位[4]。雖然已有很多的高效菌被篩選、鑒定，相關的一些降解酶基因也已被克隆表達，高效工程菌株也多見報道，但是由于有機磷農藥廢水成分復雜，某種有害成分需多種微生物同時分解，同一種菌也會對多種類似結構成分具有降解作用[5]。已有研究表明，在自然環境中，微生物在降解有機污染物時，不同種群微生物間存在協同作用，復合菌株具有較好的環境適應性，降解效果常較單一菌株好[6]，但目前國內外尚未見利用復合菌株降解有機磷農藥廢水的相關報道。本試驗針對目前有機磷農藥廢水生物處理研究和開發現狀，通過不同水質有機磷農藥生產廢水優勢降解菌種的篩選、分離、鑒定，以期獲得對有機磷農藥廢水化學需氧量（COD）降解率高的菌株及混合菌群組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗廢水及水質 試驗用廢水取自江蘇省南通市某農藥廠有機磷農藥生產廢水，原廢水清亮透明，強酸性，有強烈的刺鼻氣味，COD為156 000 mg/L，總磷含量為13 200 mg/L，BOD/COD<0.1，敵百蟲有機磷農藥殘留量4.0%左右，NaCl含量5.34%。

1.1.2 菌株來源 活性污泥樣品采自南通市某農藥廠的污水處理池。

1.1.3 藥品試劑 酵母提取物、蛋白胨為Oxide產品；PCR擴增試劑盒、DL 2000 Marker、p MD-18T 載體、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產品；DNA膠回收試劑盒（Omega）；氨芐青霉素、瓊脂糖、X-gal，IPTG為Ameresco公司產品；其他藥品均為國產分析純。

1.1.4 儀器設備 DNA Thermol Cycler4800型PCR儀，AmpGene公司；3K18高速冷凍臺式離心機，美國Sigma公司；迷你離心機，德國Eppendorf公司；DU 640紫外核酸蛋白質分析儀，美國Beckon公司；凝膠成像系統，美國Bio-Rad公司；超凈臺，蘇州凈化儀器廠；THZ-C恒溫振蕩器，太倉市光明實驗分析儀器廠；Power PAC300電泳儀，美國Bio Rad公司；恒溫水浴鍋，北京東方晶美科學儀器有限公司；Gene Pulse電轉化儀與0.2 cm的石英電轉杯，Bio-RAD公司；隔水式電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠。

1.1.5 緩沖液及培養基 ①磷酸鹽緩沖液。NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，加去離子水定容至1 L。②含20%、40%、60%、80%有機磷農藥生產廢水的無機鹽培養基。K2HPO4 0.2 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，（NH4）2SO4 0.2 g，CaSO4 0.08 g，加含有機磷農藥生產廢水20%、40%、60%、80%的去離子水定容至1 L。③牛肉膏蛋白胨培養基（培養細菌用）。牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，加pH 7.0左右的有機磷農藥生產廢水定容至1 L。④馬鈴薯培養基（培養真菌用）。去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，加有機磷農藥生產廢水定容至1 L。⑤高氏一號培養基（培養放線菌用）。可溶性淀粉20 g，KNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，加有機磷農藥生產廢水定容至1 L。⑥活化培養基。蛋白胨5 g，酵母提取物5 g，KH2PO4 1 g，加去離子水定容至1 L。⑦固體培養基。各液體培養基中添加20 g/L瓊脂。以上緩沖液和培養基均需在121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 污泥預處理 將20 mL活性污泥放入100 mL燒杯中，沉降30 min，去上清液；將底層污泥分裝到100 mL離心管中，5 000 r/min離心15 min，棄離心管上清液；用60 mL滅過菌的磷酸鹽緩沖液清洗離心管底部的泥，在上述條件下再次離心，如此操作兩次，將活性污泥中的菌釋放出來。

1.2.2 菌種馴化 采用逐漸提高有機磷農藥生產廢水濃度的方法對菌株進行馴化。洗泥后將離心管底部污泥取出，用滅過菌的50 mL無機鹽培養基將其配成污泥溶液，充分混合均勻后，加到450 mL含20%有機磷農藥生產廢水的滅菌無機鹽培養基中，28 ℃、200 r/min搖床振蕩培養，5 d后從中移取50 mL培養液加到450 mL含40%有機磷農藥生產廢水的滅菌無機鹽培養基中，28 ℃、200 r/min繼續搖床振蕩培養5 d；同樣操作轉接含60%、80%有機磷農藥生產廢水的滅菌無機鹽培養基，獲得馴化菌群。

1.2.3 菌種分離及資源庫的構建 菌株分離采用梯度稀釋涂布法，將馴化后的菌液稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5個稀釋度，分別取200 μL各梯度稀釋后的菌液涂布于對應的牛肉膏蛋白胨培養基、馬鈴薯培養基、高氏一號培養基固體平板上，于28 ℃恒溫培養箱中培養，直至長出明顯菌落。用接種環挑取形態不同的單菌落，對其進行劃線純化至新鮮固體平板中，重復純化，直至獲得純的單菌落。將純化的不同菌株轉至相對應類型的斜面培養基中，在28 ℃恒溫培養箱中培養，然后將其放入冰箱中4 ℃下保存，建立菌種資源庫，以備使用。以后每月將菌種資源庫中的各個菌株轉種至相對應類型的新鮮斜面培養基中1次。

1.2.4 高效有機磷農藥廢水降解菌的篩選 ①廢水預處理。向廢水中加入5 g/L CaCO3（方解石，0.044 mm，325目）反應3 h，將廢水pH調至7.0左右，CaCO3處理結束后過濾除去沉淀。②分別將分離的菌株擴大培養至菌濃度OD600 nm為0.5左右，與處理后的試驗廢水按體積比1∶2混合，置于250 mL錐形瓶中在 28 ℃、120 r/min搖床處理，分別取0、24、48、72、96、120 h的樣品測定其COD，直至COD趨于穩定。試驗中COD的檢測采用重鉻酸鉀法[7]，參照GB 11914-1989。有機磷農藥廢水的COD去除率=（C0-Ct）/C0×100%，式中，C0為菌株培養前的廢水COD濃度；Ct為菌株培養一定時間后的廢水COD濃度。③設不接種菌種組在相同條件下搖床培養為空白對照，以COD去除率來表示篩選得到的菌株的降解能力，初篩出COD轉化率相對較高的菌株（72 h COD去除率大于60%），保存至斜面以備用。

1.2.5 高COD去除率菌株的初步鑒定 菌株鑒定參照文獻[8-10]；菌株16S/18S rDNA序列分析由上海生工生物工程股份有限公司進行。

1.2.6 高效有機磷農藥廢水降解菌群的構建 將篩選獲得的具有高效降解有機磷農藥廢水的菌株分別進行2株菌、3株菌、4株菌等不同組合，等比例接種培養，構建不同的微生物降解菌群，檢測其72 h COD 去除率，并通過與單菌株去除率的比對，研究不同菌群組合的降解效果，每個組合設置3次重復。

2 結果與分析

2.1 有機磷農藥廢水降解菌的分離純化及資源庫的構建

以試驗廢水為培養基，將從農藥廠污水處理池中采集的活性污泥經過馴化、分離的52株具有有機磷農藥廢水降解能力的菌種建立資源庫，其中含38株細菌、9株真菌、5株放線菌，對各菌株進行編號，斜面培養基4 ℃保存備用。

2.2 菌株篩選結果

取各菌株分別處理試驗廢水，72 h COD去除率大于60%的菌株有JSBL1、 JSBL5、 JSBL6、 JSBL8、 JSBL11、 JSBL12、 JSBL15、 JSBL17、 JSBL18、 JSBL22、JSBL35、JSBL47、JSBL48、JSBL50，經計算，各菌株對COD去除率的平均值為65.2%，各菌株對廢水中COD的去除效果見圖1，由圖1可以看出，JSBL5、JSBL12、JSBL17、JSBL35、JSBL47菌株的72 h COD 去除率大于65%。

2.3 菌種鑒定結果

對篩選獲得的14株菌株進行形態學觀察和16S/18S rDNA序列分析鑒定，其中有10株細菌、4株真菌。

10株細菌菌株鑒定結果見表1。由表1可見，除JSBL17菌株為不動菌屬（Acinetobacter）、JSBL47菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus）、JSBL50為副球菌屬（Paracoccus）外，其余7株菌株均為假單胞菌屬（Pesudomonas）。

4株真菌菌株鑒定結果見表2。由表2可見，JSBL6、JSBL8、JSBL22、JSBL48真菌菌株分屬于絲孢酵母屬（Trichosporon）、曲霉屬（Aspergillus）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Piniciellum）。

2.4 高效有機磷農藥廢水降解菌群的構建

選72 h COD去除率大于65%的5個菌株JSBL5、JSBL12、JSBL17、JSBL35、JSBL47，分別進行2株菌、3株菌、4株菌和5株菌組合，等比例接種培養，檢測72 h COD去除率，通過與單菌株的降解率比對，各菌群組合的降解效果見表3。

由表3可以看出，不同菌株的菌群組合相對于單菌株而言，72 h COD去除率均升高的有JSBL17/JSBL47、JSBL5/JSBL17/JSBL47、JSBL12/JSBL17/JSBL47、JSBL17/JSBL35/JSBL47、JSBL5/JSBL12/JSBL17/JSBL47、JSBL5/JSBL17/JSBL35/JSBL47，且這6組的72 h COD去除率均大于70%，其中JSBL17/JSBL35/JSBL47組合72 h COD去除率最高，為75.8%；其余組合均有升有降，72 h COD去除率介于60.5%～69.3%。

3 小結與討論

生物處理法處理農藥廢水的關鍵是篩選高效降解菌種，污泥馴化是獲得適宜菌種的有效途徑。迄今為止，已從石油、農藥、油脂、苯酚、抗生素等廢水的污泥中分離出多種高效降解微生物。本研究通過逐漸提高有機磷農藥生產廢水濃度的方法對菌株進行馴化，其目的在于獲得對有機磷農藥廢水具有較高降解能力的高效菌株。經過篩選獲得了14株72 h COD去除率大于60%的菌株，其中10株為細菌，4株為真菌；10株細菌菌株分屬于假單胞菌屬、不動菌屬、芽孢桿菌屬、副球菌屬，4株真菌菌株分屬于絲孢酵母屬、曲霉屬、木霉屬、青霉屬；此篩選結果與已有文獻報道基本一致，分解有機磷農藥及生產污水的微生物主要是細菌，也有一些真菌，其中假單胞菌屬、芽孢桿菌屬是最活躍的菌屬，真菌以曲霉屬為主[11]。

另外，由于有機磷農藥廢水成分復雜，依靠單一的微生物無法徹底完成有機磷農藥廢水的降解，需要通過具有不同降解功能的微生物共同作用，才可能實現有機磷農藥廢水的完全降解[4]。本研究對篩選得到的72 h COD去除率大于65%的5個菌株分別進行2株菌、3株菌、4株菌和5株菌混合，構建了26組降解有機磷農藥廢水的菌群組合。根據各菌群組合的降解率可以看出，不同菌株的菌群組合相對于單菌株而言，有的升高，有的降低，這可能是由于不同菌株之間的相互作用導致的。研究發現，6組混合菌群的降解效果均比單個菌株降解效果有明顯提高，其中JSBL17/JSBL35/JSBL47組合降解率達到75.8%。已有研究認為，復合菌中的相互共存菌種越多，抗沖擊能力也就越強，這個菌群也就越穩定，因此，在實際中常采用多菌株復合降解體系，使其更貼近自然界微生物的協同生態關系[12]。本研究JSBL17/JSBL35/JSBL47組合中，3個菌株分屬于假單胞菌屬（Pesudomonas）、不動菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus），可能是3種細菌在代謝途徑上存在互補性。

本研究只是對高效有機磷農藥廢水降解菌的篩選和組合進行了初步研究，后續研究中還將對高效降解菌株和菌群組合的降解機理及溫度、pH、鹽度、時間等對降解能力的影響進行進一步研究，以為高效有機磷農藥廢水降解菌的固定化研究奠定基礎。

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