醋酸菌的營養特性分析及研究進展

李欣，黃芳，常旭，廖蓓，李志軍，陳雄，*

（1.發酵工程教育部重點實驗室，工業發酵湖北省協同創新中心，工業微生物湖北省重點實驗室，湖北工業大學，湖北武漢430068；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

醋酸菌（acetic acid bacteria，AAB）廣泛分布于自然環境中，也是發酵食品（如食醋、酒類產品、可可豆和紅茶）中的一種重要微生物[1]。醋酸菌并非一個嚴格的微生物分類學概念，而是指能以氧氣為終端電子受體，氧化糖類、糖醇類和醇類生成相應的糖醇、酮和有機酸的革蘭氏陰性細菌總稱[2]。第一個AAB屬——醋酸桿菌屬（Acetobacter spp.）是1898年由BEIJERINCK M[3]提出的。當前，已報道的AAB共16個屬，84個種[4]。至2017年年底，美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）已收錄公布了12個屬共148個AAB菌株的基因組信息。在這些屬中，由于醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacetobacter）對乙醇和乙酸的高耐受性而被廣泛應用于食品工業生產和農業領域[5-8]。本文針對這兩種醋酸菌的營養需求進行綜述。

1 醋酸菌的一般特性

醋酸菌是革蘭氏陰性或革蘭氏不定型的橢圓或桿狀細胞，呈單個、成對或短鏈狀排列。醋酸菌不形成芽孢，菌體周生或端生鞭毛，因而具有運動能力。生長最優pH值是5.0～6.5，而它們能夠在更低pH值（3～4）下生長[9]。除少量種屬中的菌株具有一定的耐熱性[10-11]，絕大部分的醋酸菌最適生長溫度在28℃～30℃之間。

以醋化醋酸桿菌（A.aceti）為代表的醋酸桿菌屬能氧化乙酸鹽和乳酸鹽，能氧化乙醇產乙酸，泛醌為Q-9型[1]。以液化葡糖醋桿菌（Ga.liquefaciens）為典型菌株的葡糖醋桿菌屬能氧化葡糖酸鹽和醋酸鹽，能氧化酒精產醋，輔酶Q為Q-10型[1]。

2 醋酸菌常用的培養基

培養基是開展微生物研究的最基礎的材料。不同培養基適應于不同類型微生物。對醋酸菌基本培養而言，最常用的培養基是由5%葡萄糖和1%酵母浸膏組成的葡萄糖-酵母浸膏培養基[12]。在此基礎上衍生改良的葡萄糖-酵母浸膏-碳酸鈣培養基、葡萄糖-酵母浸膏-蛋白胨-乙醇培養基和葡萄糖-酵母浸膏-蛋白胨-醋酸-乙醇培養基[13-15]以及酵母抽提物-蛋白胨-甘露醇培養基和麥芽提取物-酵母浸膏-乙醇培養基[16]被用于醋酸菌的分離和富集。此外，強化醋酸乙醇培養基（4%葡萄糖、1%酵母浸膏、1%蛋白胨、0.33%Na2HPO4·2H2O、0.15%檸檬酸、適量乙酸和乙醇）和 Dobereiner無氮培養基（0.06%KH2PO4、0.02%MgSO4、0.002%CaCl2、0.001%FeCl3、0.000 2%Na2MoO4、10%庶糖，pH4.5）分別適用于耐酸（醇）和固氮醋酸菌的培養[17-18]。經典的赫斯特林-施拉姆培養基（hestrinschramm，HS），組份包括2%葡萄糖、0.5%酵母浸粉、0.5%蛋白胨、0.375%Na2HPO4和0.115%檸檬酸）被用于合成細菌纖維素的醋酸菌的分離[19]。不同醋酸菌的性能具有較大的差異，往往還需要針對性的開展培養基優化工作。孫文瑛等結合Plackett-Buramn實驗、最陡爬坡實驗和Box-Behnken實驗方法對醋桿菌1IA1的發酵產酸培養基進行優化，獲得以乙醇、葡萄糖、酵母粉和乙酸為主要成分的含有金屬鹽的醋酸發酵培養基[20]。

3 碳源

碳源和能量源是影響醋酸菌生長的關鍵因子。醋酸桿菌能利用糖作為碳源以支撐自身的生長代謝過程，然而，它們對糖類的利用差異既表現在種間，也反映在種內。不同菌株可轉化產酸的糖類有很大的不同[21]。醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacebacter）均無法利用D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、蜜二糖、蔗糖、棉子糖、三梨醇和己六醇。葡糖醋桿菌屬能利用D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖和甘油。這兩個屬中的部分菌株能利用L-阿拉伯糖、D-木糖和D-甘露糖。部分葡糖醋桿菌屬菌株能利用L-山梨糖和D-甘露醇。部分醋酸桿菌屬菌株能利用D-葡萄糖和D-半乳糖。醋酸桿菌不能利用甘油，而葡糖醋桿菌能利用。此外，一些多糖也能被葡糖醋桿菌利用[22]。醋酸桿菌能通過多條代謝途徑利用糖，如磷酸己糖途徑、糖酵解途徑（embden-meyerhof-parnas pathway，EMP） 和 2-酮-3-脫氧-6-磷酸葡萄糖酸途徑（entner-doudoroff pathway，ED）[23]，但是不同種屬間的醋酸菌糖代謝產能的效率不同，相對于醋酸桿菌，糖更適于作為葡糖醋桿菌屬（Gluconacebacter）的碳源。

對醋酸菌而言，乙醇是一種雙功能營養物質，既可以被視為生長碳源，也是產酸促進劑。王麗麗等發現乙醇對液體深層醋酸發酵工業生產菌株滬釀1.01的菌體生長有促進作用[24]。宋勇強等以提高甘肅傳統食醋中的1株優勢醋酸菌A3產酸量為目標，采用正交設計與人工神經網絡模型相結合的方法，確定發酵初始乙醇濃度為4.2%[25]。張衛華等運用響應面法優化醋酸菌發酵條件，確定的乙醇濃度為6.1%vol[26]。一般而言，當乙醇醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacebacter）以乙醇為碳源進行生長時，其生長過程經歷3個階段。首先，乙醇能快速被氧化成乙酸，并伴隨著乙酸從周質空間釋放到外界環境。這一時期也被稱為乙醇氧化期。隨后，醋酸菌進入生長穩定期，其可育細胞數減少或降低生長產率。第三個生長期為乙酸氧化期，期間乙酸在細胞質內被可溶性乙醇脫氫酶（alcoho dehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）分解，同時伴隨能量的產生和碳源的同化作用[27]。

相對于醋酸桿菌屬，葡糖醋桿菌屬具有更多樣化的功能和作用，如固氮作用、合成纖維素、生產水溶性棕色素[28-31]。葡萄醋桿菌屬在可利用碳源上展現了多樣性。Singh等針對Gluconacetobacter xylinus C18，基于中心復合旋轉設計的響應面優化方法建立了以糖蜜（10.77%）和玉米漿（12.47%）為主的培養基，其最大細菌纖維素產量達到4.34 g/L[32]。Bilgi E等通過PB（Plackett-Burman）和中心組合設計獲得一個以糖蜜和玉米漿為主營養的產細菌纖維素（4.24 g/L）的發酵體系[33]。除葡萄糖外，乙酸和乳酸也可作為額外的碳源以支撐葡糖醋桿菌的生長和細菌纖維素的生產[34]。此外，一些工業和農業廢棄物，如發酵廢液和腐爛的水果，也被作為糖醋桿菌合成細菌纖維素的營養組分[35-36]。

4 氮源

氮源是培養基中重要營養組分，對維持醋酸菌代謝具有重要作用，如醋酸菌催化乙醇轉化乙酸的代謝過程中會消耗氨基酸[37]。大部分醋酸菌能夠使用無機氮源硫酸銨作為唯一氮源，因為它們能利用氨合成所有氨基酸[38-39]。培養基中的自由氨基酸是AAB很好的氮源[40-41]。20種氨基酸混合物能替代水解酪蛋白用于弱氧化醋桿菌（Acetobacter suboxydans）的生長[42]。為避免配制培養基的麻煩，往往在培養基中使用蛋白胨或酵母浸粉，它們能確保為醋酸菌的生長提供一個總量的氮源。

醋酸菌對氨基氮源的需求極大的受到菌株和使用培養條件的影響[43]。早期文獻報道纈氨酸對弱氧化醋酸桿菌（Acetobacter suboxydans）的生長是必需的，而且，纈氨酸、異亮氨酸、丙氨酸和組氨酸是滿足該菌生長的最小氨基酸組合，盡管增加這些氨基酸的濃度并不會顯著促進生長，但減少將會導致生長能力顯著降低[44]。然而，Kerwar等的研究卻顯示不一致的結果。他們認為纈氨酸對弱氧化醋酸桿菌的生長有抑制作用，但是添加異亮氨酸能消除纈氨酸所引起的生長抑制效應[45]。Belly和Claud在分析弱氧化醋酸桿菌ATCC 621的營養需求時，指出在一個全合成的不含氨基酸的培養基中添加谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和組氨酸能刺激生長，而甘氨酸的促生長能力較弱[46]。蘇氨酸和高絲氨酸對醋化醋桿菌（Acetobacter aceti）的生長有抑制效應[47]。Sainz研究了兩株蘋果醋桿菌（A.malorum）對氨基酸和銨鹽需求特征，結果顯示以M9培養基為對照，添加脯氨酸能明顯促進蘋果醋桿菌1437和7742的生長，同時，丙氨酸只對菌株7742有顯著的促生長效果。此外，這兩個醋酸菌在谷氨酸、谷氨酰胺或絲氨酸存在下還具有大部分生長能力，但是在單一銨離子條件下的生長能力非常弱[48]。Yin等以巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）AC2005為研究對象，從16種氨基酸中篩選出3種對細菌生長有顯著促進作用的3種氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸和脯氨酸），并重點研究了前兩種氨基酸的促生長效果。細菌生長、可培養細菌數、乙酸產量和乙酸生產速率分別提高了1.04、5.43、1.45、3.30 倍；添加谷氨酸后，這些指標分別增長 0.51、0.72、0.60、0.94 倍[49]。

5 溶氧

醋酸菌通過不完全氧化過程（也稱為氧化發酵）利用細胞膜結合的脫氫酶在周質空間內將底物氧化成產物（一般為酸）[50]。以輔酶Q為主體的電子傳遞鏈負責將電子從底物轉移到最終的電子受體氧分子上[51-54]。因此，氧是氧化發酵完成必不可少的重要營養因子。氧氣的可利用程度會嚴重影響發酵速率和產率[55-57]。同時，溶氧不足也會導致醋酸菌從可培養狀態轉變為存活但不可培養狀態（viablebutnon-culturable，VBNC）[58]，這將嚴重影響了醋酸菌的篩選、培養和發酵研究開展。還有研究表明溶氧水平對葡糖醋桿菌G.xylinus形成的細菌纖維素的晶體構型、厚度和性能均產生影響[59]。

6 其它營養需求

醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖醋桿菌屬（Gluconacebacter）能氧化乙酸和乳酸形成二氧化碳和水。乙酸是一個雙功能營養物質，既可以作為碳源，也可以作為培養基的緩沖體系。當作為營養因子時，高濃度的乙酸并不抑制醋酸菌的生長，但過量的乙酸（15 mol/L，pH值=1.8）會限制細菌的生長[60]。適量的丙酸也具有促進作用，但鹽酸和磷酸等無機酸及乳酸并不具有相似的功能[61]。培養基緩沖能力和離子強度對G.xylinus BCRC12334固態發酵生產細菌纖維素有顯著的影響，200 mmol/L pH 4.75乙酸緩沖培養基中的細菌纖維素產量為3.56 g/L，遠高于葡萄糖-酵母浸粉-蛋白胨培養基（2%葡萄糖、0.5%酵母浸粉和0.5%蛋白胨）（0.66 g/L）和 HS培養基（1.23 g/L）[62]。此外，檸檬酸也常被作用緩沖溶劑用于木醋桿菌（Acetobacter xylinum）的培養中[63]。

醋酸菌對維生素的需求研究受到的關注極少，只有零星片段的研究報告。生黑醋桿菌（Acetobacter melanogenum），氧化醋桿菌（Acetobacter oxygans）和惡臭醋桿菌（Acetobacter rancens）都要求泛酸（pantothenic acid，維生素 B5）、煙酸（nicotinic acid），但氧化醋桿菌不需要硫銨（Thiamin，維生素 B1）[64]。

醋酸菌對金屬鹽的需求沒有系統的研究結果報告。在一些情況下，碳酸鈣通常作為pH調節劑而被使用。磷酸鹽也被作為醋酸菌的營養成分之一[65]。

7 結論

從第一例醋酸菌被發現以來，篩選獲得的醋酸菌菌株數量急劇增加，種屬得到極大擴展，作用功能也越來越豐富。研究者已經設計出了多種適用于不同研究目的的培養基，但是它們僅能滿足醋酸菌基本的生長要求。同時，醋酸菌營養需求的研究主要集中于廉價碳源的篩選和發酵效果評價及氨基氮源的生理功能，而對微量元素，如維生素和金屬鹽的研究極少收到關注。然而，不同種屬、不同菌株在不同的應用條件所需要的營養需求都有差異。因此，更精細的揭示營養元素對醋酸菌的影響和作用機制，深入到基因表達調控、蛋白表達差異和代謝等水平，更有助于理解醋酸菌的多樣性、差異性和獨特性[66]。

醋酸是一種重要的有機化工產品，在化工、輕紡、塑料、醫藥、橡膠以及染料等行業有著十分廣泛的用途[67]。同時，食醋是人們在日常生活中廣泛食用的調味品。利用醋酸菌轉化食用酒精是高濃度食醋的主要生產方法。開發低成本高效率的醋酸發酵營養鹽是醋酸菌研究的重要方向，如江南大學研發了由水解酵母粉（26.5%）、檸檬酸銨（15.5%）、葡萄糖（44.8%）、磷酸氫二鉀（4.2%）和磷酸氫二鈉（3.7%）組成的醋酸菌發酵營養鹽[68]。目前，中國市場上應用最廣泛的醋酸菌培養基是進口德國的弗林斯醋酸菌發酵營養鹽，主要由酵母浸出物、無機鹽和生長因子等物質復配得到，雖然使用方便，但價格昂貴。中國最大的酵母制造商安琪酵母有限公司也開發出用于液態米醋發酵和酒精醋發酵的3種型號營養鹽。然而，相比進口產品，在促生長和促代謝方面，國產營養鹽還存在微弱的差異與不足。因此，基于醋酸菌營養需求特征，開展精細化改進和優化是未來營養鹽研究的重要方向。