甜味蛋白特性及其表達的研究進展

何明娟，鄒曙明，蔣霞云，劉寧

（上海海洋大學 食品學院，上海 201306）

甜味是深受人們喜愛的一種味覺，到目前為止，人類已經發(fā)現(xiàn)并使用的甜味劑大概有20種，可分為糖醇類甜味劑、非糖甜味劑、人工合成的非營養(yǎng)甜味劑三類。1968年，人們首次從植物果實中分離得到一種能將酸味變?yōu)樘鹞兜牡鞍踪|—Miraculin，從而開始了對天然甜味蛋白的研究和應用，但大自然植物中提取到的甜味劑種類較少，且工藝困難，使用率較低。

1 甜味蛋白的種類

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的植物甜味蛋白有8種，即Brazzein、Thaumatin、Monelin、Curculin、Mabinlin、Miraculin、Pentadin和新近發(fā)現(xiàn)的Neoculin。其中，Brazzein、Thaumatin、Monellin、Mabinlin、Pentadin這5種為甜味蛋白，它們本身就具有甜味；Miraculin和Neoculin為甜味誘導蛋白，具有甜味調節(jié)功能，可以使酸味等其他味感變?yōu)樘鹞叮籆urculin兼有前兩類蛋白質的甜味特性。

1.1 Thaumatin

Thaumatin，又稱索馬甜、沙馬汀，是從非洲竹芋科植物Thaumatococcus daniellii的果實中分離出的一類強烈甜味的蛋白質，為淡黃褐色至灰褐色粉末，無臭味，味極甜。Thaumatin甜味閾值為1.1 mg/kg，在高于甜味閾值濃度時，甜度為蔗糖的5 500～8 000倍[1]。Thaumatin均由一條多肽鏈組成，分子量約為22 kD，等電點在11.5～12.5，屬于堿性蛋白，加熱可發(fā)生變性而失去甜味，Thaumatin在酸性條件下熱穩(wěn)定性好，在堿性或中性條件下熱穩(wěn)定性相對較差。

1.2 Monellin

Monellin，中文被稱為莫奈林，是從西非的一種植物Dioscoreophy Ilum cummitasii中分離得到的。Monellin分子由A、B兩條鏈共94個氨基酸殘基組成，A、B兩條鏈通過非共價相互作用結合在一起。影響Monellin蛋白穩(wěn)定性的因素有共價鍵作用力和非共價鍵作用力，蛋白表面的電荷和氨基酸殘基會對它的甜味產生影響，尤其是Ca2+，這可能與味細胞中的Ca2+介導的陽離子通道有關。Monellin蛋白活性受溫度和pH的影響，50 ℃以上、pH較低的條件下，蛋白失活，甜味降低[2]。

1.3 Mabinlin

Mabinlin，即馬檳榔甜蛋白，是從中國云南等省的高海拔地區(qū)白花菜科植物Cappari Smasaikai Levi的種子中分離提純到的一種甜蛋白。Mabinlin蛋白有4種同系物，分別為MabinlinⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，MabinlinⅡ相關的研究最多。MabinlinⅡ由A、B兩條鏈組成，A鏈含有33個氨基酸殘基，B鏈含有72個氨基酸殘基。MabinlinⅡ熱穩(wěn)定性最好，甜度約是等質量蔗糖的400倍，其甜味在80 ℃至少可保持48 h不被破壞，而其他3種在80 ℃下保持0.5 h甜味就喪失[3]。

1.4 Brazzein

Brazzein，中文被譯為布拉珍，是從非洲西部野生植物Pentadiplandra Brazzeana的果實中分離提純得到的。Brazzein是由54個氨基酸殘基組成的單鏈多態(tài)，相對分子質量為6.5 kDa，等電點為5，甜度約是等質量蔗糖的2000倍。Brazzein是一種單鏈蛋白，是在植物甜味蛋白家族相對分子量最小的。Brazzein甜味蛋白水溶解性、熱力學穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性都較好，Brazzein分子在85 ℃時仍保持折疊形式，即使在80℃下熱處理4 h依然保持甜味活性，在高pH值溶液中也仍保持甜味活性[4]。

1.5 Pentadin

Pentadin，被譯為培它丁，是1989年從非洲熱帶植物Pentadiplandra Brazzeana的果實中分離提取出的。其分子量為12 kDa，甜度為蔗糖的500倍，整個分子是以亞結構通過二硫鍵相連的。Pentadin和Brazzein來自同一種植物，Pentadin是果實經熱干燥后提取得到的，Brazzein是從鮮果中提取得到的。Pentadin是非天然形態(tài)的交聯(lián)Brazzein分子，分子量約為Brazzein的2倍，且甜度明顯低于Brazzein[5]。

1.6 Curculin

Curculin，又稱仙茅蛋白、庫克靈，是從馬來西亞石蒜科光葉仙茅植物Curculingo Latifolia的果實中分離得到的。它是一種不含糖基的單純蛋白，有含114個氨基酸殘基，等電點為7.1，對熱敏感，50 ℃以上活性降低，其甜度約為等質量蔗糖的2 000倍。它的甜味消失后，可用檸檬酸或維生素C誘導恢復并產生強烈的甜味，其本身具有甜味又能使檸檬酸等有機酸變甜。

1.7 Miraculin和Neoculin

Miraculin，中文被譯為奇異果素、奇果蛋白等。是從西非植物Richadelladulcifa Baehni的紅色漿果中提取得到。Miraculin相對分子量約為24.6 kDa，是由191個氨基酸和N連接寡糖組成的單一多肽鏈，等電點約為9。Miraculin蛋白在100 ℃以下、pH 3～12范圍內比較穩(wěn)定，其本身并無甜味，遇到酸性物質后可以改變人的味覺，因此稱其為矯味蛋白。

Neoculin是一種與Curculin同源且具有味道修飾作用的甜味蛋白，甜度約是等質量蔗糖的500倍。Neoculin是一種由一個N端糖基化酸性亞基NAS和一個基本單位NBS組成的異二聚體糖蛋白，Neoculin一維和三維結構均類似于單子葉植物中的甘露糖凝集素[6]。

2 甜味蛋白表達研究進展

2.1 Thaumatin的表達研究進展

研究人員在不斷地進行Thaumatin的轉基因表達，曾將Thaumatin基因轉入不同的宿主，但都沒有獲得大量重組的具有活性的Thaumatin。2004年，孔建強等[7]利用基因工程技術，將分別克隆在兩個不同載體上的甜味蛋白基因連接成一個完整的cDNA基因，并將該基因克隆進載體pBI121，通過凍融法導入農桿菌，再轉入煙草植株，雖然在成熟煙草植株中檢測到甜味蛋白目的基因，但并沒有在轉基因煙草中檢測到表達的甜味蛋白。2007年，研究人員將基因導入到大麥中，大大提高了產量，平均每千克大麥可以產 2 g蛋白[8]。

2.2 Monellin的表達研究進展

Monellin蛋白已實現(xiàn)了在原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)中的表達。將Monellin在畢赤酵母中表達，并利用響應面優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基，但表達量較低，或存在產物活性偏低的現(xiàn)象。為了實現(xiàn)高效表達，學者多將研究重點轉向根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性Monellin基因進行優(yōu)化，獲得了令人滿意的結果。通過在Monellin蛋白中不同位點的氨基酸的丙氨酸取代獲得突變體，并評估其熱穩(wěn)定性和甜味閾值的變化，其結果表明，通過基因突變技術可以改善天然Monellin蛋白的熱穩(wěn)定性和甜味，可以實現(xiàn)Monellin的工業(yè)化生產。

2.3 Mabinlin的表達研究進展

至今，對Mabinlin Ⅱ基因研究主要是在各種植物、原核生物中表達。研究人員已經成功地在根癌農桿菌的介導下將Mabinlin Ⅱ基因導入萵苣、西瓜、番茄中，通過分析，確定已將Mabinlin Ⅱ蛋白基因成功整合到重組植物的基因組中。2009年顧文亮等[9]對Mabinlin Ⅱ基因進行剪切重組，再克隆至大腸桿菌表達載體pET-30a(+)，將其導入大腸桿菌BL21（DE3）中表達，在IPTG誘導下，重組Mabinlin Ⅱ基因首次在大腸桿菌中表達。2011年王昌博等[10]將兩種形式的重組Mabinlin Ⅱ導入大腸桿菌中表達，經誘導后成功表達，雙盲測試可檢測到輕微甜味和后甜感。

2.4 Brazzein的表達研究進展

Brazzein在原核生物中的表達主要集中在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌，尤其是在以大腸桿菌作為表達菌的研究中，目的蛋白的產量及生物活性都有了很大提高。王長遠等[4]為了提高甜味蛋白Brazzein的產量及甜度，將第29位的天冬氨酸、第31位的組氨酸和第41位的谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼帷⒈彼帷①嚢彼幔瑢幋a區(qū)進行優(yōu)化，構建甜味蛋白Brazzein的乳酸乳球菌表面表達系統(tǒng)，結果驗證甜味蛋白Brazzein成功表達于乳酸乳球菌表面。趙紅玲等[10]將含有Brazzein基因的pPIC9K穿梭質粒通過電轉入巴斯德畢赤酵母GS115中，表達產物經電泳鑒定，其相對分子量與理論值一致，并得到有微甜味的表達產物。

2.5 Curculin、Miraculin和Neoculin的表達研究進展

現(xiàn)今關于Curculin的加工制備研究相對較少，對比于其他甜蛋白基因工程技術在仙茅蛋白表達中的應用相對滯后。研究表明，Miraculin的合成基因可以在在大腸桿菌中表達，也可在番茄中實現(xiàn)高效表達。目前尚未有成功表達Curculin的報道，但Neoculin已被成功表達，Nakajima等[6]利用帶有KEX2剪切位點的α-淀粉酶分別與兩個蛋白亞基融合，成功獲得與天然Neoculin具有同樣活性的重組Neoculin。

3 甜味蛋白鑒定方法和甜度測定方法

3.1 甜味蛋白的鑒定

常用的甜味蛋白鑒定分析方法有SDS-PAGE、免疫印跡及蛋白的質譜檢測三種。將得到的甜味蛋白進行SDS-PAGE定性分析，探究重組基因是否在宿主內表達了目的甜味蛋白、甜味蛋白的分子量大小是否與預估值相符、也能做簡單的定量分析。將SDSPAGE上的純化后的蛋白使用免疫印跡分析鑒定基因是否表達。將SDS-PAGE上的純化后的蛋白使用MALDI-TOF/TOF串聯(lián)質譜進一步分析鑒定，確定蛋白的氨基酸序列。

3.2 甜味蛋白的甜度測定

甜味蛋白是一種新型的甜味劑，甜度測試方法一般采用雙盲檢測法。將100 mL發(fā)酵液在4 ℃條件下，以5 000 r/min冷凍離心5 min，收集的細胞加10 mL無菌去離子水重新懸浮。冰浴中100 W超聲波破碎15 min，超聲3 s，停止3 s。菌液在4℃以12000 r/min冷凍高速離心20 min，收集上清液。用0.25 μm孔徑濾膜的過濾器過濾，取少量濾液進行活性測試，同時針對陰性對照和目的甜味蛋白的上清液，采取多人員進行雙盲測試，感官評定比較其甜度。

4 挑戰(zhàn)與前景

傳統(tǒng)的天然植物蛋白的產量不高，研究人員為獲得安全高產量的甜蛋白利用分子生物學技術克隆其編碼區(qū)，運用基因工程技術，根據(jù)氨基酸序列人工合成甜味蛋白基因，然后將甜味蛋白基因轉入微生物或高等植物中進行外源表達。在這些研究進行的過程中，想要應用基因工程技術生產甜味蛋白，重組質粒的穩(wěn)定性、基因工程菌的穩(wěn)定性、目的基因在宿主中能否表達，基因表達的誘導條件、所表達的蛋白的甜味活性以及尋找甜味的科學檢測方法，都是需要面對和克服的困難。雖然微生物發(fā)酵生產甜味蛋白仍處于實驗階段，但隨著酵母、大腸桿菌等表達系統(tǒng)研究的不斷深入，利用基因工程菌生產甜味蛋白具有極其誘人的前景。