小黑麥不同品種劣變種子的胚培養效果研究

李 雪，田新會，杜文華

(甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

小黑麥(Triticalewittmack)為禾本科一年生草本植物，由小麥(Triticum)和黑麥(Secale)經屬間有性雜交和雜種染色體加倍而成的新物種，不僅表現了小麥的豐產性和籽粒的優良品質，又保持了黑麥抗逆性強和賴氨酸含量高的特點，是一種很有前途的糧飼兼用型作物[1-3]。

種子的劣變是指因種子生存能力降低、導致種子喪失生活力和萌發力的不可逆轉變化，是伴隨著種子貯藏時間延長而發生的、不可避免的過程[4]。在劣變過程中種子內部發生一系列生理生化變化，種子的各種功能和結構受到損害[5-7]，其損害程度隨時間延長而逐漸加劇，從而導致種子質量下降，種子活力下降，甚至喪失生活力[8-9]。這主要是因為，雖然胚具有活力，但胚乳喪失了為胚萌發提供營養物質的能力，從而使胚由于缺乏營養而失去活力[10]。

植物胚是一個具有全能性的多細胞結構，通常能夠正常發育成熟，而且可以直接播種形成完整植株。通過離體胚培養，使可能敗育或退化的胚獲得再生植株，在植物育種中具有十分重要的理論與實踐意義[11-12]。

胚培養可以追溯到18 世紀，Charles Bonnet分離并培養了菜豆和蕎麥的胚并獲得了植株[13-14]。較為系統的胚挽救技術開始于20 世紀初，目前胚挽救技術已被廣泛地應用于小麥[15]、大麥[16-17]、水稻[18]、茄子[19]、油菜[20]、百合[21]、以及眾多果樹如桃[22]、葡萄[23-24]、櫻桃[25]、蘋果[26]、柿[27]、李[28]、柑橘[29-30]等。Sirkka等最早進行小黑麥胚挽救技術研究[31]。目前國內外對小黑麥劣變種子胚挽救技術研究較少。為提高劣變種子的利用率和挽救種質資源，試驗以10份澳大利亞小黑麥品種的劣變種子為試材，在體外進行胚培養，以比較各品種的胚發育率、胚萌發率和成苗率，為小黑麥種質資源挽救提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為引自澳大利亞10個小黑麥品種(Cherokee，While M96-3182-1，33rd ITSN，DH265，AT315，Rhino，AT574，AT528，32rd ITSN，2090White)的劣變程度相同的種子。對照為甘肅農業大學草業學院培育的小黑麥新品系C24(CK1)和C31(CK2)，在室溫條件下保存一年的種子。

1.2 培養基

1/2MS+2%蔗糖+0.1%麥芽糖+0.5%瓊脂， pH 5.8，于121℃高壓滅菌20 min。

1.3 種子消毒及接種

先將參試材料的種子沖洗干凈，用次氯酸鈉消毒5～10 min，再用蒸餾水沖洗干凈。將沖洗干凈的種子浸泡在蒸餾水中，放置4℃冰箱24 h。

將浸泡的種子在無菌操作臺用次氯酸鈉消毒5～10 min，無菌水沖洗干凈并用無菌濾紙將種子干燥。用鑷子將種皮剝除，然后將胚從胚和胚乳連接處切出，完整的胚盾片向上接種到培養基中。

1.4 培養及轉接

將接種好的胚放置于17℃、光照16 h、黑暗8 h的培養箱中進行培養。當胚發芽至3片葉時，轉移到花盆。

1.5 試驗設計

將引自澳大利亞10個劣變小黑麥品種(Cherokee，While M96-3182-1，33rd ITSN，DH265，AT315，Rhino，AT574，AT528，32rd ITSN，2090White)和對照材料經種子消毒及接種后在培養箱中培養，每個處理設3次重復，每天定時進行觀察，每隔5 d統計小黑麥的胚發育率、成苗率，直至小黑麥的胚發育率、成苗率不在變化。

1.6 測定指標及方法

接種的胚長出綠芽或須根時為胚發育，胚發育率為發育胚數占接種胚珠數的百分率[32]。

胚發育率(%)=胚發育數/接種胚數×100%

成苗率為正常苗數占接種胚珠數的百分率。正常苗為具有正常的根、莖和葉等器官的植株[32]。

成苗率(%)=成苗數/接種胚數×100%

1.7 數據分析

用SPSS19.0軟件中二因素隨機區組試驗設計的統計方法，分別分析不同小黑麥材料間、培養時間間和品種×培養時間交互作用間胚發育率、胚萌發率和成苗率方差的差異顯著性，進行方差分析時將胚發育率和成苗率進行數據轉換(反正弦轉換)。如果差異顯著，用Duncan法進行多重比較。對小黑麥的胚發育率和成苗率進行相關性分析。用Excel進行數據整理和作圖。

2 結果與分析

小黑麥材料間，誘導培養天數間以及小黑麥材料間×誘導培養天數交互間的胚發育率和成苗率存在極顯著差異(P<0.01)，需進行多重比較(表1)。

2.1 胚發育率

2.1.1 小黑麥材料間胚發育率的差異 參試的12份小黑麥材料中，2個對照的胚發育率相近，顯著高于其余材料；Cherokee和DH265的胚發育率顯著高于其余參試材料；小黑麥材料2090White、AT528、While M96-3182-1、AT574和AT315的胚發育率依次降低，且有顯著差異；33rd ITSN和、32rd ITSN和Rhino的胚發育率為0(表2)。

表1 小黑麥胚發育率和出苗率的方差結果分析

注：**達到極顯著水平(P<0.01)，下同

表2 小黑麥材料間胚發育率和成苗率的差異

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.1.2 培養天數間胚發育率的差異 由于小黑麥品種33rd ITSN、32rd ITSN和Rhino的胚發育率為0，所以從培養天數間胚發育率差異的影響中去除。隨著培養天數增加，小黑麥胚的發育率逐漸增加(表3)。0～7 d時，小黑麥材料的胚發育率顯著低于其他培養天數；7～12 d時，胚發育率增加較快，增加率為25.4%；隨著誘導培養時間的繼續延長，胚發育率增加幅度減緩，27 d和32 d時，胚發育率無顯著差異。

表3 誘導培養天數間胚發育率和成苗率的差異

2.1.3 小黑麥材料×培養天數交互作用間胚發育率的差異 CK1和CK2的胚發育率在誘導培養12 d時已經完全發育，顯著高于其余小黑麥材料。隨著誘導培養天數增加，各參試小黑麥材料胚發育率的變化有差異，Cherokee誘導培養7 d的胚發育率較低，為57.65%，隨著誘導天數增加，胚發育率逐漸增加，27、32 d時胚發育率顯著增加；DH265誘導培養7 d的胚發育率較高(83.33%)，胚發育率隨著誘導天數的增加而緩慢增加，22 d時胚發育率顯著增加，27，32 d時胚發育率還在增加，但無顯著差異；2090White誘導培養7 d時，胚發育率較低(31.18%)，12、17、22 d時胚發育率增加速度較快，差異顯著(P<0.05)，27、32 d的增加緩慢，無顯著差異(P>0.05)；AT528的胚發育率在誘導培養7 d時胚發育率為56.67%，12 d時胚發育率顯著增加，誘導培養12、17、22、27 d胚發育率增加緩慢，無顯著差異。AT315在誘導培養7 d時，胚發育率較低(5%)，12，17 d胚發育率顯著增加，17 d較12 d高118.95%，27，32 d胚發育率顯著增加；While M96-3182-1誘導培養7 d時胚發育為11.76%，12、17、22、27 d胚發育率增加，均差異顯著，27 d和35 d胚發育率無顯著差異。AT574誘導培養7 d時胚發育率為0，誘導培養12 d胚發育率為25.56%，誘導培養17，22和27 d胚發育率顯著增加，誘導培養35 d胚發育率增加緩慢，無顯著差異(圖1)。

圖1 小黑麥材料×培養天數交互作用下的胚發育率Fig.1 Triticale materials×days of inducting culture of difference embryo development rate between interaction注：柱形圖間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

2.2 成苗率

2.2.1 小黑麥材料間成苗率的差異 對照材料的成苗率顯著(P<0.05)高于其余材料。參試小黑麥材料劣變種子的成苗率為8.23%～57.16%，Cherokee的成苗率最高,為57.16%，顯著高于其余參試小黑麥材料；DH265次之，其成苗率顯著高于除CK1、CK2和Cherokee之外的其他材料；2090White和AT528的胚成苗率相近，居第3位；其余材料的胚成苗率較低(表2)。

2.2.2 誘導培養天數間成苗率的差異 誘導培養7 d時，小黑麥材料的成苗率為0。隨著誘導培養天數增加，成苗率逐漸增加，除27 d和32 d間小黑麥材料的成苗率無顯著差異外，其余天數間的胚成苗率均有顯著差異(P<0.05)。誘導培養17 d時，小黑麥成苗率比12 d高67.18%，22 d的成苗率比17 d高18.90%，27 d的成苗率比22 d高7.65%；誘導培養時間27 d后，隨著培養時間延長，成苗率增加緩慢(表3)。

2.2.3 小黑麥材料×培養天數交互作用間成苗率的差異 CK1和CK2在誘導培養12 d時已經全部成苗，其成苗率顯著(P<0.05)高于其余小黑麥材料。參試的小黑麥材料在誘導培養7 d時成苗率均為0。Cherokee誘導培養12 d時成苗率較低(6.47%)，誘導培養17 d時成苗率顯著增加，但誘導培養22，27和32 d增加緩慢，差異不顯著；DH265在誘導培養12 d時成苗率為0，誘導培養17、22 d成苗率顯著增加，27、35 d成苗率增加緩慢，無顯著差異；2090White的成苗率在誘導培養12，17和22 d成苗率顯著增加，27、35 d成苗率增加緩慢，差異不顯著；AT528誘導培養12 d的成苗率較高(40.67%)，17 d成苗率顯著增加，22，27和35 d的成苗率增加緩慢，差異不顯著；AT315在誘導培養12 d時成苗率為0，17、22 d成苗率顯著增加，27、35 d成苗率無差異顯著性；While M96-3182-1誘導培養12 d時成苗率為6.62%，誘導培養17 d成苗率顯著增加，高于241.24%，22 d時成苗率顯著增加，27、35 d成苗率增加差異不顯著；AT574誘導培養12 d、17 d成苗率為0，誘導培養22，27和35 d成苗率增加，但無差異顯著(圖2)。

圖2 小黑麥材料×培養天數交互作用的成苗率Fig.2 Triticale materials×days of inducting culture of difference seedling rate among interaction

2.3 胚發育率和成苗率的相關性分析

小黑麥材料的胚發育率和成苗率相關性分析(表4)表明，小黑麥的胚發育率和成苗率呈極顯著正相關(R=0.97)。

表4 胚發育率和成苗率的相關性分析

2.4 再生苗移栽的幼苗成活率、株高和葉片數

對照CK1和CK2的成活率最高，顯著高于其他參試小黑麥材料。劣變的種子胚成活率為9.55%～69.42%，且不同品種差異顯著，其中Cherokee成活率最高，其次為DH265，AT315的成活率最低(表5)。

對照CK1和CK2的平均株高最高，顯著高于其余參試小黑麥材料。AT528平均株高較高，為16.40 cm，和CK2無顯著差異，其次為Cherokee，While和M96-3182-1，AT574的平均株高最低。

小黑麥品種AT528的平均葉片數最高，顯著高于其余參試小黑麥材料；其次為CK1、Cherokee和AT315，3品種的平均葉片數無顯著差異；AT574的平均葉片數最少，除與2090White無顯著差異外，顯著低于其余參試小黑麥。

3 討論

貯藏時間對種子的萌發具有較大的影響。張東暉等[33]研究表明，隨貯藏時間延長，種子劣變加劇，但有一定的安全貯藏期。貯藏14年喪失活力，貯藏7～8年失去種用價值，貯藏6年活力驟然下降，不宜作為播種用，貯藏4年保持較高的活力，適當可作播種用，也可作為種質資源保存期延長至6年，貯藏2～3年活力表現最強，說明其種用價值最佳。試驗選用不同程度劣變種子進行研究，表明正常的種子胚的發育率和成苗率較高，并且由于劣變種子的劣變程度不同，其發育率和成苗率各異，發育率由高到低依次為：CK2>CK1>DH265>Cherokee>2090White>AT528>WhileM96-3182-1> AT754>AT315，成苗率依次為：CK2>CK1>Cherokee>DH265>2090White>AT528>WhileM96-3182-1> AT754>AT315。從而說明DH265和Cherokee的劣變程度較輕，2090White和AT528居中，其余3個材料種子的劣變程度較重，而33rd ITSN，32rd ITSN和Rhino小黑麥種子已經喪失了活力。和張東暉等[33]的研究結果類似。不同植物種類或品種胚培養存在較大差異。傅雪琳等[34]研究發現，成熟稻材料間胚愈傷組織誘導率、質地結構和綠苗再生率有顯著差異。王丹菲等[35]用不同百合品種雜交獲得的幼胚為外植體，進行離體胚培養發現，不同雜交組合的胚發育率差異較大。試驗材料DH265和Cherokee的劣變程度較輕，但2個材料間的胚發育率和成苗率還有顯著差異。由于成苗率和胚發育率極顯著正相關，所以對其差異原因沒有單獨列出。

胚培養時間對胚挽救具有重要作用，張月琴等[36]研究表明，小麥成熟胚培養12 d就可以達到理想的分化效果，唐冬梅等[37]研究表明，無核葡萄不同基因型的胚培養時間不同。試驗結果表明，隨著誘導天數增加，參試小黑麥材料的胚發育率逐漸增加。誘導培養7～12 d時胚發育率和成苗率增加幅度較大，誘導培養27 d和32 d時小黑麥材料的胚發育率和成苗率無顯著差異，說明小黑麥胚培養的適宜誘導培養時間為27 d。

由小黑麥材料×誘導培養天數間的胚發育率和成苗率差異可知，CK1和CK2的胚發育率和成苗率在誘導培養12 d時，均達100%，但劣變小黑麥材料種子在誘導培養27 d時，胚發育率仍沒有達到100%，表明種子劣變對胚萌發有很大影響。參試的每種小黑麥材料的胚發育率和成苗率隨著時間的增加而增加，但增加的速度不同。材料Cherokee的胚發育率在7～12 d時增加較快，而2090White在17～22 d增加快，AT315和WhileM96-3182-1隨著時間的增加呈階梯式增加，其余材料的胚發育率顯著增加，但幅度不大。小黑麥材料2090White和AT528的成苗率在7-12 d時增加幅度較大，Cherokee和DH265在12-17d時增加快，其余材料增加勻速增加。趙占軍等[38]研究胚齡對小麥幼胚組織培養效果中表明，幼胚組織培養最適宜的胚齡為14～16 d。孫蘇陽等[39]研究表明，小麥胚齡為16 d 時，其萌發率和成苗率較高，是較為合適的幼胚培養時期。材料33rd ITSN，32rd ITSN，Rhino隨著誘導培養時間的增加而無變化，可能由于其種子劣變時間較長，而失去活力。

4 結論

小黑麥材料間胚發育率由高到低依次為：CK2>CK1>DH265>Cherokee>2090White>AT528> WhileM96-3182-1>AT754>AT315，成苗率的順序為：CK2>CK1>Cherokee>DH265>2090White>AT528> WhileM96-3182-1>AT754>AT315；小黑麥品種33rd ITSN、32rd ITSN和Rhino的胚發育率和成苗率均為0，完全失活；對劣變小黑麥的種子沒喪失活力的胚進行培養，最適宜的時間為27 d。

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