植酸不同水解率產物對結直腸癌移植模型腫瘤細胞分化的影響

(青島大學公共衛生學院，山東 青島 266021)

目前，結直腸癌在惡性腫瘤中的發病率位居第三位[1]，在全世界癌癥死亡率中居第四位[2]。隨著人們飲食習慣的改變，結直腸癌發病率呈現上升的趨勢。植酸(IP6)是一種天然存在的碳水化合物，存在于高纖維食物(如谷類和豆類)中，其中以豆類植物種子、谷物麩皮和胚芽中含量最高[3-6]。大量的體內和體外實驗證明植酸對于多種腫瘤具有抑制作用[7-12]。SAAD等[13]研究顯示，植酸不會對正常細胞的生長產生不良影響。臨床研究顯示，癌癥患者在化療期間接受植酸干預之后，能夠很好地改善生活質量[14]。惡性腫瘤的發生與細胞分化失常有關，誘導腫瘤細胞分化成為治療腫瘤的一種新途徑。國外一些學者研究顯示，植酸可以通過誘導結直腸癌分化來抑制腫瘤的惡性發展[15]。來源于神經細胞瘤的骨髓細胞瘤病毒相關癌基因(N-MYC)下游相關基因1(NDRG1)是從分化的結直腸癌細胞中分離出來的一種新的基因，在細胞分化中發揮著至關重要的作用。NDRG1能夠誘導腫瘤分化[16-17]，抑制腫瘤轉移[18-19]。膳食中的植酸進入人體后，在腸道菌群酶的作用下，能水解成植酸水解產物，而植酸水解產物也具有抗癌活性，能夠抑制結直腸癌細胞生長[20]。我們課題組前期研究顯示，100 mg/L的30%和90%植酸水解率產物對CT-26細胞的增殖抑制效果較植酸明顯。本研究以此為基礎，通過建立結直腸癌移植瘤小鼠模型，研究植酸及其水解產物對NDRG1蛋白表達的影響，探討植酸水解產物與植酸產生的效果之間的差異，并進一步探討其誘導腫瘤分化的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株及細胞培養

小鼠結腸腺癌細胞株CT-26購買自中國科學院上海細胞庫。將CT-26細胞置于含有體積分數為0.15的胎牛血清以及青鏈霉素(青霉素的濃度為100 kU/L，鏈霉素濃度為0.1 g/L)的RPMI-1640培養基中，于37 ℃、含體積分數0.05的CO2恒溫培養箱中培養。

1.2 動物及飼養

雄性BALB/c小鼠28只，6～8周齡，體質量18～22 g(山東魯抗醫藥股份有限公司)。在SPF條件下，在平均溫度(24±2)℃，平均濕度(52±8)%環境下適應性喂養7 d，食用飼料，自由飲水。

1.3 試劑

植酸鈉購于北京華邁科公司(純度≥98%)；30%和90%植酸水解率產物為實驗室制備。Wes-tern blot相關試劑購買于碧云天生物技術公司。NDRG1抗體購于英國Abcam公司，N-MYC抗體、同源磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)抗體、β-actin抗體購于美國Proteintech Group生物技術有限公司。

1.4 小鼠結直腸癌皮下移植瘤模型制備及分組

將含有5×109個/L細胞的CT-26細胞懸液注射到小鼠右側背部皮下，每只注射0.1 mL。待生長至2周且腫瘤體積達到1 cm×1 cm大小時造模成功，將造模成功的28只小鼠按照腫瘤結節大小進行隨機區組分組，分為生理鹽水組(A組)、30%植酸水解率產物組(B組)、90%植酸水解率產物組(C組)及植酸組(D組)4組，每組7只小鼠。分組后第2天，小鼠分別給予生理鹽水及濃度為100 mg/L的30%植酸水解率產物、90%植酸水解率產物和植酸，進行瘤體四周多點注射，每次注射0.1 mL，每周2次，連續注射10周。

1.5 腫瘤體積計算及病理學觀察

在藥物干預期間，每周測量并記錄瘤塊大小。于末次注射藥物后12 h(禁食禁水)，處死小鼠。摘除小鼠背部的腫瘤，測量腫瘤體積。用多聚甲醛固定，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后進行病理學觀察。計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(對照組平均腫瘤體積-實驗組平均腫瘤體積)/對照組平均腫瘤體積×100%

1.6 Western blot方法檢測腫瘤組織內N-MYC、NDRG1、PTEN蛋白表達情況

取約50～100 mg腫瘤組織，用無菌手術剪將組織剪成細小的碎片，然后加入含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，提取腫瘤組織的總蛋白。用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。測定完成后向各組蛋白中加入上樣緩沖液，混勻，然后加熱，使蛋白變性。蛋白冷卻后加入到SDS-PAGE凝膠上電泳分離，將分離后的蛋白分子轉移至PVDF膜上。再用含脫脂奶粉的TBST封閉2 h后，漂洗3次，加入一抗孵育3～4 h，漂洗后重新加入二抗孵育2 h。加入ECL發光液放入FusionFX5顯影儀中顯影，得到目的蛋白條帶。以目的蛋白與內參灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。實驗重復3次，結果取均值。

2 結 果

2.1 各組小鼠的一般情況

小鼠接種CT-26細胞后，C組和D組的小鼠精神狀態良好，行動均自如。A、B、C、D組分別有6、7、7、7只小鼠存活至實驗結束。A組1只小鼠死于藥物干預期間，可能是與腫瘤體積較大，腫瘤處發生潰爛而引起的。B、C、D組小鼠的腫瘤抑制率分別為26.8%、56.73%、43.21%，C組小鼠的抑制率高于D組。

2.2 各組小鼠腫瘤抑制情況

A、B、C、D組小鼠的腫瘤體積分別為(10.71±1.34)、(8.24±0.46)、(4.75±0.80)、(6.67±1.96)cm3，A組的小鼠腫瘤體積較大，個別腫瘤組織內出現糜爛壞死結構；B組小鼠腫瘤體積與A組相比差異無統計學意義(P>0.05)；與A組相比，C組及D組腫瘤組織體積相對較小且未出現糜爛壞死結構，差異具有統計學意義(F=23.13，P<0.05)；C組小鼠腫瘤體積明顯小于D組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 各組小鼠腫瘤組織病理檢查結果

A組與B組小鼠腫瘤組織內細胞緊密，排列混亂，細胞核深染，核質比增大。D、C組小鼠腫瘤組織內細胞排列相對整齊，核染色較淺(圖1)。

1、2、3、4分別為A、B、C、D組，HE染色，200倍。

圖1各組小鼠腫瘤組織免疫組織化學觀察結果

2.4 各組小鼠移植瘤組織中NDRG1、N-MYC和PTEN蛋白的表達

與A組相比，C組和D組N-MYC蛋白的表達水平降低(F=30.65，P<0.05)，NDRG1和PTEN蛋白的表達水平明顯升高，差異有統計學意義(F=20.73、14.69，P<0.05)；C組的效果優于D組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2各組小鼠移植瘤組織中NDRG1、N-MYC和PTEN蛋白的表達情況

組別N?MYCNDRG1PTENA組1．38±0．220．50±0．090．53±0．11B組1．24±0．110．59±0．110．80±0．10C組0．46±0．051．53±0．301．30±0．22D組0．74±0．110．91±0．110．85±0．12

3 討 論

植酸的水解產物由多種次級磷酸化形式組成，包括五磷酸肌醇、四磷酸肌醇、三磷酸肌醇、二磷酸肌醇、一磷酸肌醇以及肌醇，付余英[21]研究顯示，當植酸水解率達到83%和100%時，植酸水解產物主要為一磷酸肌醇和肌醇。肌醇也可以發揮溫和的抗腫瘤作用。國外研究顯示，肌醇能夠有效地降低乳腺癌細胞分化和傳播速度[22-23]。國內研究顯示，植酸和肌醇聯用能夠對結直腸癌發揮更好的抑制作用[24-25]，因此我們認為90%水解率時的主要產物是肌醇，它可以與植酸聯合發揮抗腫瘤作用，抑制結直腸癌生長。我們課題組的前期研究顯示，100 mg/L的90%水解率產物對CT-26細胞的抑制效果相對植酸較明顯[20]。前期關于植酸水解產物的研究主要集中在工業方面，而將其用于動物實驗的研究卻較少[26-27]。本研究以此為基礎，進行動物實驗，建立BALB/c小鼠結直腸癌移植瘤模型，顯示C組和D組小鼠腫瘤體積相比A組明顯減小，這表明90%水解率產物和植酸均能抑制腫瘤的生長，并且90%水解率產物的效果優于植酸，這與我們前期的研究結果相一致。

腫瘤的發生與細胞分化失調有關，細胞分化的調控，受到多因素多方面的影響。在對植酸及其水解產物誘導結直腸癌分化機制的研究中，本研究觀測了植酸及其水解產物對分化相關因子NDRG1、N-MYC以及PTEN表達的調控。結果顯示，A組中小鼠NDRG1蛋白表達水平較低，C組和D組的NDRG1蛋白表達水平明顯高于對照組，這表明植酸及其水解產物可以通過上調NDRG1蛋白表達，誘導結直腸癌細胞分化，抑制腫瘤的生長及發展。NDRG1基因的表達會受到較多種因素的影響。NDRG1是N-MYC的下游基因，受到N-MYC的調控[28-29]，本研究結果顯示，A組小鼠N-MYC蛋白的表達水平明顯上升，且NDRG1蛋白水平呈低表達，腫瘤體積增長速度較快。這表明90%水解率產物可以抑制N-MYC蛋白的積累，從而促進其下游NDRG1的表達，誘導腫瘤細胞向正常細胞分化，逆轉其惡性表型，抑制腫瘤發展。國外一些學者證實，PTEN和NDRG1的表達具有顯著的相關性[30-31]。本研究結果顯示，植酸及其水解產物組的PTEN蛋白表達水平高于對照組，這表明植酸及其水解產物上調了PTEN的表達，增強了NDRG1的表達水平，誘導腫瘤細胞分化，進而抑制腫瘤生長。

綜上所述，本研究建立了結直腸癌移植瘤小鼠模型，顯示30%和90%植酸水解產物能夠誘導結直腸癌分化，通過對分化相關因子NDRG1、N-MYC以及PTEN的進一步研究顯示，植酸及其水解產物能夠提高NDRG1和PTEN蛋白的表達水平，降低N-MYC蛋白的表達水平，誘導腫瘤細胞向正常細胞分化，且90%植酸水解產物抑制腫瘤的效果優于植酸。植酸不同水解率產物抗腫瘤作用及其機制的進一步研究，對于癌癥的防治具有重要意義，但其誘導結腸癌分化的具體作用機制有待進一步的觀察。

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