P2X4對帕金森病模型大鼠黑質中α突觸核蛋白表達的影響

(青島大學附屬醫院神經內科，山東 青島 266100)

帕金森病(PD)是一種常見的神經退行性疾病，該病典型臨床癥狀為靜止性震顫、肌強直、運動遲緩和姿勢平衡障礙[1]。其病理特點是中腦多巴胺能神經元的丟失，以及α突觸核蛋白(α-synuclein)為主要成分的路易小體的形成[2]。已有研究表明，炎癥、線粒體功能障礙、氧化應激等參與了PD的發生發展過程[3-5]。這些為PD的治療提供了新的靶點。

P2X4受體是一種三聚體的通道蛋白的嘌呤受體，在大腦、脊髓組織中均有廣泛分布，P2X4受體在T淋巴細胞上也有表達，有促進T細胞活化及抗原呈遞作用[6]。小膠質細胞被激活后可發揮巨噬細胞的功能，激活包括P2X4受體在內的多種受體，促進多種炎性因子釋放，此過程參與了神經病理性疼痛、癲癇等多種神經系統疾病的發生、發展過程[7-8]。神經炎癥是PD的重要發病機制之一，我們推斷在PD的動物模型中P2X4參與了小膠質細胞的激活過程，從而介導PD的發病。本研究通過觀察6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的PD模型大鼠黑質酪氨酸羥化酶(TH)陽性多巴胺能神經元數量以及測定P2X4、半胱氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)、α-synuclein蛋白的表達水平，探討P2X4對PD模型大鼠黑質中多巴胺能神經元的潛在影響。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級雄性Wistar大鼠120只(購于青島市實驗動物和動物實驗中心)，體質量200～250 g，單籠飼養，置于(20±2)℃室溫，大鼠自由飲水、攝食。將120只大鼠隨機分為6組(每組20只)，分別為對照組(A組)、6-OHDA組(B組)、P2X4-NC組(C組)、siRNA-P2X4+6-OHDA組(D組)、siRNA-P2X4組(E組)、P2X4-NC+6-OHDA(F組)。大鼠完全適應實驗室環境后可進行實驗。

1.2 器材與試劑

冷凍切片機(Leica公司，德國)；腦立體定位儀(瑞沃德公司，中國)；熒光顯微鏡(Carl Zeiss公司，德國)；PCR儀(ABI，美國)；10 μL微量注射器(Stoelting，美國)；P2X4慢病毒(吉凱公司)；P2X4抗體(Alamnelabs，以色列)；caspase-1抗體(Abcam公司，英國)；α-synuclien抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology，美國)；TH抗體(Millipore，美國)；驢抗兔熒光二抗(Life Technologies，美國)；6-OHDA、阿撲嗎啡(APO)(Sigma，美國)；SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Qiagen，德國)；逆轉錄試劑盒(Thermo，美國)；Trizol(Takara，日本)。

1.3 PD模型大鼠的制備

各組大鼠稱體質量后，以100 g/L水合氯醛按400 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉；備皮后將大鼠牢固固定在立體定位儀上，經碘附和乙醇消毒后，由頭部的正中矢狀位切開頭皮，露出前囟。根據大鼠腦立體定位圖譜[9]，定位左側黑質(前囟后5.0 mm，中線左側2.1 mm，深度7.7 mm)，用牙科鉆在已定好位置鉆孔，隨后用微量注射器吸取0.3 μL陰性對照慢病毒或攜帶目的基因的慢病毒在大鼠左側黑質處定位注射，針頭滯留5 min后緩慢拔出。A組、B組、C組、E組分別通過立體定位儀用微量注射器向大鼠左側黑質注射生理鹽水、6-OHDA、攜帶空載siRNA的慢病毒、攜帶抑制P2X4表達的目的siRNA-P2X4慢病毒；D組、F組分別注射攜帶抑制P2X4表達的目的siRNA-P2X4慢病毒和攜帶空載siRNA的慢病毒，2周后進行6-OHDA(4 g/L)黑質內注射。

1.4 成模標準

完成上述實驗操作后2周，腦內注射6-OHDA的大鼠向腹腔內注射濃度為0.5 g/L的APO，劑量為0.5 mg/kg，10 min后觀察并記錄大鼠旋轉次數，觀察60 min，平均轉速>6 r/min為成功模型，否則為不成功模型。剔除死亡及造模失敗的大鼠后，A、B、C組均剩余16只大鼠，D、E、F組均剩余15只大鼠。

1.5 Western blot法檢測P2X4、caspase-1、α-synuclein蛋白的表達

將6組大鼠各取10只以100 g/L水合氯醛腹腔麻醉后斷頭取腦，取左側黑質組織，分別置于EP管中，每個EP管內加入200 μL細胞裂解液(其中含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑)，研磨棒研磨組織，置于冰上裂解30 min后，置于低溫離心機中(4 ℃條件下)12 000 r/min離心15 min后提取上清液，采用BCA法測定蛋白的含量。取1μL蛋白樣品用0.01 mol/L的PBS稀釋至20 μL，加入96孔板中，將標準品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加至標準品孔中，用0.01 mol/L的PBS補足至20 μL。BCA試劑A和試劑B依照50∶1的比例配制BC工作液。各孔內均加入200 μL BC工作液，在烤箱中放置30 min，溫度37 ℃，根據標準曲線計算出蛋白濃度。蛋白樣品中加入上樣緩沖液(2×Loading buffer)后充分混勻，100 ℃條件下煮10 min。以SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，蛋白上樣(上樣量為每孔20 μg)后，恒壓80 V條件下電泳，待樣品進入分離膠后將恒壓調整為120 V，時間約60 min。將分離好的蛋白質從凝膠轉移至PVDF膜上，后恒電流300 mA轉膜90 min。以體積分數0.05脫脂牛奶室溫封膜2 h，分別添加一抗孵育(anti-P2X4，1∶200；anti-TH，1∶4 000；anti-caspase-1，1∶2 000；anti-GAPDH，1∶10 000)，4 ℃搖床過夜。第2天用PBST洗滌3次，加入二抗(HRP標記的山羊抗兔IgG，1∶10 000)后室溫下搖床孵育1 h，PBST洗滌3次進行顯影，用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。實驗結果以目的蛋白與GAPDH條帶灰度的比值表示目的蛋白的表達水平，所得結果進行統計學分析。

1.6 免疫熒光染色

參照相關文獻報道的方法[10]。各組剩余大鼠稱體質量后以100 g/L水合氯醛麻醉，用生理鹽水及40 g/L的多聚甲醛溶液經左心室灌注固定后斷頭，取腦組織后在40 g/L多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h，分別在200 g/L蔗糖溶液、300 g/L蔗糖溶液中脫水后，置于-80 ℃冰箱保存。在鼠腦冠狀位連續切片時，冷凍切片機切片調整為厚度20 μm，溫度為-20 ℃，采用細針將冷凍切片輕輕粘至加入0.01 mol/L的PBS的24孔板中，盡量避免損傷腦組織。冷凍切片剝離皮質部位后采用PBST沖洗，加入TH一抗(1∶2 000)、α-synuclein一抗(1∶1 000)、caspase-1一抗(1∶500)，置于4 ℃搖床孵育過夜。用PBST反復沖洗3次，每次持續5 min。加驢抗兔熒光二抗(1∶500)，室溫避光搖床孵育2 h后再次用PBST沖洗3次，每次持續5 min。避光貼片，腦片周圍自然干燥后用700 g/L甘油溶液封片，鏡下觀察。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠黑質中P2X4、α-synuclein、caspase-1的表達情況

Western blot檢測結果顯示，與A組比較，B組和F組大鼠黑質內P2X4表達明顯增加，差異有統計學意義(F=111.9，P<0.01)；C組、D組大鼠黑質內P2X4表達較F組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。與A組比較，B組大鼠黑質內α-synuclein的表達明顯增加，差異具有統計學意義(F=152.9，P<0.01)；D組大鼠黑質內α-synuclein表達較F組減少，差異有統計學意義(P<0.01)。與A組比較，B組大鼠黑質內caspase-1表達明顯增加，差異具有統計學意義(F=141.3，P<0.01)；D組大鼠黑質內caspase-1蛋白表達較F組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1，圖1。

2.2 各組大鼠黑質中TH陽性的多巴胺能神經元數量比較

免疫熒光染色結果顯示，干擾慢病毒在黑質TH陽性的多巴胺能神經元中穩定表達(圖2)。與A組比較，B組和F組黑質TH陽性多巴胺能神經元數量明顯減少，差異具有統計學意義(F=27.16，P<0.01)；與F組比較，C組和D組大鼠黑質內TH陽性多巴胺能神經元數量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。與A比較，C組和E組大鼠黑質內TH陽性多巴胺能神經元數量差異無顯著意義(P>0.05)。見表1，圖3。

組別P2X4α?synucleincaspase?1TH陽性多巴胺神經元數量A組0．596±0．0150．652±0．0330．562±0．0167363．0±171．7B組1．129±0．0371．254±0．0341．064±0．0215320．0±269．0C組0．678±0．0350．536±0．0170．666±0．0186940．0±141．5D組0．841±0．0381．071±0．0400．784±0．0256132．0±165．7E組0．458±0．0170．594±0．0190．734±0．0117250．0±246．0F組1．232±0．0231．337±0．0231．204±0．0304799．0±203．7

圖1 各組大鼠中α-synuclein、P2X4、caspase-1蛋白的表達

A為TH在大鼠黑質中表達情況；B為重組慢病毒在大鼠黑質中表達情況；C為重組慢病毒在TH陽性的多巴胺能神經元中表達情況。TH染色，400倍。

圖2TH陽性的多巴胺能神經元慢病毒的轉染情況

①、②、③、④、⑤、⑥分別為A、B、C、E、D、F組。TH染色，100倍。

3 討 論

PD的典型病理特征為中腦黑質致密部多巴胺能神經元丟失、以α-synuclein為主要成分的路易小體形成以及紋狀體多巴胺水平降低[11]。尸檢發現，PD病人的黑質中有大量活化狀態的小膠質細胞，而且活化的小膠質細胞數量與神經變性程度呈正比[12-13]。小膠質細胞對α-synuclein有很強的內吞、降解作用，當小膠質細胞被激活后，對α-synuclein的降解作用降低，未被降解的α-synuclein可發生錯誤的折疊而異常沉積在胞質內，造成小膠質細胞進一步激活[14]。這種正向的反饋使α-synuclein持續沉積，造成細胞內線粒體功能障礙、內質網-高爾基體囊泡運輸障礙，增加多巴胺神經元的氧化應激，加快多巴胺能神經元的死亡進程[15]。

P2X4受體作為一種分布廣泛的嘌呤能受體，在大腦、脊髓、自主和感覺神經節和垂體前葉均有分布[16]。P2X4異常的上調及活化引起的免疫應答反應與多種疾病的發生發展有關，與神經退行性疾病也有一定關系[17-19]。P2X4受體激活后可誘導下游的信號通路激活，從而調控前列腺素、IL-1、TNF-α、IL-6、caspase-1等炎性因子活化，參與包括周圍炎癥性疼痛、糖尿病腎間質性炎癥、癲癇等疾病的病理過程[20]。最新研究表明，P2X4受體通過激活小膠質細胞參與了慢性乙醇中毒引起的神經退行性損傷的炎性發病機制[21]，我們推測P2X4表達上調可能也參與了PD的發生過程。

本實驗結果顯示，在6-OHDA誘導的PD大鼠模型中，大鼠黑質中P2X4、α-synuclein的蛋白表達水平較正常對照組有所升高，PD模型中黑質內TH陽性多巴胺能神經元細胞數量明顯下降，這些結果表明P2X4可能參與了PD的發病過程。使用抑制P2X4表達的慢病毒預處理后，大鼠黑質中P2X4蛋白表達較PD組有所下降，TH陽性多巴胺神經元細胞數量上升，說明干擾P2X4表達可抑制TH陽性多巴胺能神經元的死亡，大鼠黑質中α-synuclein的蛋白水平較PD組下降，TH陽性細胞數升高，進一步驗證P2X4表達下調可起到神經保護作用。為了明確P2X4表達下調在PD的炎癥機制中的具體作用機制，本研究還對caspase-1蛋白進行了檢測。caspase家族是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，不僅在炎癥反應中起重要作用，而且介導了某些特定類型細胞的凋亡。caspase-1可被炎癥小體激活，通過切割IL-1β、IL-18前體，促進多種炎癥因子釋放參與炎癥反應[22]。已有研究表明，caspase-1與α-synuclein的聚集與神經細胞毒性作用有直接關系[23]。從本實驗結果可以看出，各組大鼠之間黑質中P2X4、α-synuclein與caspase-1蛋白結果的變化是基本同步的，P2X4表達下調可直接或間接下調caspase-1的表達，由此推斷P2X4表達下調可通過抑制caspase-1的表達來減少α-synuclein的表達。

綜上所述，本實驗通過檢測大鼠黑質內TH陽性多巴胺神經元細胞數量以及P2X4、α-synuclein、caspase-1蛋白表達量的變化，證實P2X4在PD模型發病機制中具有一定作用，P2X4表達下調能夠影響α-synuclein的表達，對大鼠黑質內的多巴胺能神經元起保護作用，這為PD的病因治療提供了新的思路。

[1] WEINTRAUB D, COMELLA C L, HORN S. Parkinson’s disease-part 1:Pathophysiology, symptoms, burden, diagnosis, and assessment[J]. Am J Manag Care, 2008,14(2 Suppl):S40-48.

[2] BOHNEN N I, ALBIN R L, KOEPPE R A, et al. Positron emission tomography of monoaminergic vesicular binding in aging and Parkinson disease[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2006,26(9):1198-1212.

[3] BARZILAI A, MELAMED E. Molecular mechanisms of selective dopaminergic neuronal death in Parkinson’s disease[J]. Trends Mol Med, 2003,9(3):126-132.

[4] TSUDA M, MASUDA T, TOZAKI-SAITOH H. P2X4 receptors and neuropathic pain[J]. Front Cell Neurosci, 2013,7(1):1-5.

[5] NAVARRO-GONZALEZ J F, MORA-FERNANDEZ C. The role of inflammatory cytokines in diabetic nephropathy[J]. J Am Nephrol, 2008,19(3):433-442.

[6] 周金鳳,覃朝燕,賴煒明,等. 嘌呤P2受體的免疫調節功能[J]. 中國細胞生物學學報, 2015(8):1151-1157.

[7] TSUDA M, KUBOYAMA K, INOUE T, et al. Behavioral phenotypes of mice lacking purinergic P2X4, receptors in acute and chronic pain assays[J]. Mol Pain, 2009,5(1):28.

[8] TIELE S L, WARRE R, NASH J E. Development of a unila-terally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson’s disease[J]. J Vis Exp, 2012,60(60):e3234.

[9] 包新民,舒斯云. 大鼠立體定位圖譜[M]. 北京：人民衛生出版社, 1991.

[10] 孫筱璇,薛莉,周暢,等. 晚期糖基化終末產物受體對帕金森病模型小鼠腦內酪氨酸羥化酶表達的影響[J]. 中國臨床神經科學, 2017,25(1):1-7.

[11] HORNYKIEWICZ O, KISH S J. Biochemical pathophysiology of Parkinson’s disease[J]. Adv Neurol, 1987,45(Suppl 2):19-34.

[12] SPILLANTINI M G, CROWTHE R, JAKES R, et al. Alpha-Synuclein in filamentous inclusions of Lewy bodies from Parkinson’s disease and dementia with lewy bodies[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998,95(11):6469-6473.

[13] HIRSCH E C, HUNOT S, DAMIER P, et al. Glial cells and inflammation in Parkinson’s disease:a role in neurodegeneration[J]? Ann Neurol, 1998,44(1):115-120.

[14] LEE H J, SUK J E, BAE E J, et al. Clearance and deposition of extracellular alpha-synuclein aggregates in microglia[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008,372(3):423-428.

[15] LEE H J, PATEL S, LEE S J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates[J]. J Neurosci, 2005,25(25):6016-6024.

[16] HANSEN C, ANGOT E, BERGSTR?M A L, et al. α-Synuclein propagates from mouse brain to grafted dopaminergic neurons and seeds aggregation in cultured human cells[J]. J Clin Invest, 2011,121(2):715-725.

[17] YAMAMOTO K, KORENAGA R, KAMIYA A, et al. P2X(4) receptors mediate ATP-induced calcium influx in human vascular endothelial cells[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000,279(1):H285-292.

[18] SHEN Y Q, HEBERT G, SU Y. In mice, production of plasma IL-1 and IL-6 in response to MPTP is related to behavioral lateralization[J]. Brain Res, 2005,1045(1-2):31-37.

[19] HRACSKO Z, BARANYI M, CSOLLE C, et al. Lack of neuroprotection in the absence of P2X7 receptors in toxin-induced animal models of Parkinson’s disease[J]. Mol Neurodegener, 2011,6(1):28.

[20] TSUDA M, SHIGEMOTO-MOGAMI Y, KOIZUMI S, et al. P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allody-nia after nerve injury[J]. Nature, 2003,424(6950):778-783.

[21] ASATRYAN L, OSTROVSKAYA O, LIEU D, et al. Ethanol differentially modulates P2X4 and P2X7 receptor activity and function in BV2 microglial cells[J]. Neuropharmacology, 2017,128:11-12.

[22] LI P, ALLEN H, BANERJEE S, et al. Mice deficient in IL-1β-converting enzyme are defective in production of mature IL-1β and resistant to endotoxic shock[J]. Cell, 1995,80(3):401-411.

[23] WANG W, NGUYEN LT, BURLAK C, et al. Caspase-1 causes truncation and aggregation of the Parkinson’s disease-associated protein α-synuclein[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016,113(34):9587-9592.