不同干酵母發酵豆粕的揮發性成分分析

李 開，宋 昊，王 冬，鄭玉芝*

（1.北京一輕研究院，北京 101111；2.北京市食品工業研究所，北京 100075）

豆粕含有40%～60%的蛋白質，除此之外，還含有硫胺素、核黃素、煙酸等維生素以及大豆低聚糖、大豆異黃酮等活性成分[1]；大豆蛋白是公認的一種全價蛋白，含有人體所需的9種必需氨基酸[2-3]。

不良風味一直以來都是大豆類產品在食品工業中深度開發利用的主要障礙，目前已有許多關于大豆類產品風味物質的研究。BOUé S M等[4]跟蹤研究了大豆在不同發育時期的揮發性化合物，總共鑒定出49種化合物，主要包含酯、酮、醇。LV Y等[5]在豆漿中鑒定出8種豆腥味化合物和4種非豆腥味化合物。研究表明，含有大豆蛋白產品的不良風味（如豆腥味）主要是由不飽和脂肪酸的氧化所引起的[6]。黃友如等[7]研究表明，乙醇處理能有效改善大豆分離蛋白的風味，主要是由于乙醇處理去除了1-辛烯-3-醇和降低了己醛、乙酸乙酯等的含量。施小迪等[8]利用β-環糊精包埋技術顯著降低了豆乳中的豆腥味。SURATMAN L L I等[9]發現，α-環糊精降低豆奶中豆腥味的效果更好。另外，也有將微生物發酵技術應用于大豆類產品風味的改善，LEEJEERAJUMNEAN A等[10]用芽孢桿菌發酵大豆后，發現風味化合物的含量增加了100倍。BLAGDEN T D等[11]發現，乳酸桿菌和鏈球菌能降低豆奶氣味物質中甲醇和乙醇的含量。目前，還鮮見關于豆粕及豆粕發酵后的揮發性成分的研究。

本研究采用4種不同品牌的干酵母發酵豆粕，利用頂空固相微萃?。╤eadspacesolid-phasemicroextraction，HS-SPME）和氣相色譜-質譜聯用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS），采用主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）對豆粕發酵前后的揮發性物質進行分析研究，以期為更好地開發利用豆粕有價值的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粕（食品級）：山東禹王實業有限公司；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；馬利酵母：新疆馬利食品有限公司；舒可曼酵母：廣西湘桂酵母科技有限公司；超凡酵母：山東圣琪生物有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜質譜聯用儀：美國安捷倫科技有限公司；SPME手動進樣器、HS-SPME萃取頭（50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷）：美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 豆粕發酵

稱取干酵母0.5 g置于三角瓶中，加入50 g去離子水，在37℃條件下振蕩培養箱中振蕩培養1h，備用；稱取豆粕50g置于培養盒中，倒入準備好的酵母培養液，混勻，在37℃恒溫培養箱中發酵2 h（發酵時間來自酵母粉說明書）。

1.3.2 頂空-固相微萃取

[12]的方法，取適量的樣品，置于15 mL頂空樣品瓶中，密封，60℃平衡30 min。將預先進行高溫老化后的SPME針頭插進頂空樣品瓶中，推出萃取纖維頭，在60℃進行頂空固相微萃取30 min，最后將萃取頭插進氣相色譜儀進樣口，240℃解吸5 min，進行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS檢測條件

氣相色譜條件：DB-WAX石英毛細柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）色譜柱；進樣口溫度：240℃；升溫程序：40℃保持3 min，以5℃/min升至120℃，保持4min，8℃/min升溫至200℃，保持8 min，10℃/min升至240℃，保持10 min；載氣氦氣（He）流速1.5 mL/min，不分流。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度240℃；離子源溫度230℃；母離子285 m/z；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍35.00～500.00 m/z。

1.3.4 數據處理

利用安捷倫質譜數據處理系統結合NIST 11標準質譜庫對總離子流色譜圖中的各峰進行檢索，確定每個峰對應的化學成分，并用峰面積歸一化法計算各化學成分的相對含量。利用Matlab 2016b對4種不同酵母發酵豆粕中的揮發性成分進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 豆粕的揮發性化學成分

發酵前豆粕的揮發性成分的總離子流色譜圖見圖1，各組分的鑒定結果見表1。

由表1可知，發酵前，豆粕的揮發性物質包括醇、醛、酯、酸、酮和烴類。其中，醇類化合物10種，占58.13%；醛類化合物7種，占10.47%；酯類化合物6種，占16.08%；酸類化合物3種，占2.45%；酮類化合物4種，占5.11%；烴類化合物6種，占7.76%。由于烴類化合物的氣味閾值較高，因此對豆粕的風味的形成貢獻不大，1-辛烯-3-醇、1-己醇、酯類化合物和醛類化合物為豆粕的主要揮發性成分。1-辛烯-3-醇的相對含量為34.03%，具有不愉快的蘑菇味和油膩味，是大豆產品中的主要異味成分[13]。在豆粕的脫脂過程中，與蛋白質共價結合的脂質無法被正己烷去除，在豆粕的加工貯藏過程中這些殘留脂質中的亞油酸等不飽和脂肪酸，在脂肪氧合酶的催化下，被氧化為氫過氧化物，氫過氧化物再被氫過氧化物裂解酶、氧化還原酶等催化生成1-辛烯-3-醇等醇類和羰基化合物，形成了豆粕特殊的風味[6，14-15]。

圖1 發酵前豆粕的揮發性成分GC-MS分析的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components in soybean meal before fermentation analysis by GC-MS

表1 豆粕發酵前后主要揮發性成分的變化Table 1 Changes of main volatile components in soybean meal before and after fermentation

續表

續表

2.2 豆粕發酵后的揮發性成分

分別經4種干酵母發酵后的豆粕的揮發性成分的總離子流色譜圖如圖2所示，發酵后揮發性成分鑒定結果見表1。由表1可知，豆粕發酵后揮發性物質的類別為醇、醛、酸、萜烯、酮、雜環、酯和烴類，與發酵前相比，揮發性物質增加了十幾種，萜烯、雜環是新增加的種類。

圖2 不同干酵母發酵后豆粕的揮發性成分GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components in fermented soybean meal with different dry yeasts analysis by GC-MS

發酵前后豆粕中揮發性成分按種類的數量分析結果見圖3。

由圖3可知，在安琪酵母發酵后的豆粕中，共有54種揮發性成分。其中，醇類14種，占54.77%；酯類13種，占15.06%；酮類4種，占11.16%；醛類8種，占9.72%；酸類8種，占4.54%；烴類6種，占3.89%；雜環1種，占0.86%。其主要揮發性成分是1-辛烯-3-醇（14.62%）、3-甲基-1-丁醇（12.47%）、1-己醇（10.24%）、苯乙醇（9.26%）、酯類及酮類。

圖3 發酵前后豆粕中揮發性成分的種類分析Fig.3 Varieties analysis of volatile compounds in soybean meal before and after fermentation

在馬利酵母發酵后的豆粕中，共有51種揮發性成分。其中，醇類12種，占51.11%；酯類17種，占20.32%；酮類2種，占5.89%；醛類7種，占6.67%；酸類5種，占3.74%；烴類6種，占9.88%；雜環2種，占2.38%。其主要揮發性成分是3-甲基-1-丁醇（13.87%）、1-辛烯-3-醇（11.22%）、1-己醇（11.01%）、苯乙醇（5.44%）及酯類。

在舒可曼酵母發酵后的豆粕中，共有57種揮發性成分。其中，醇類13種，占49.57%；酯類14種，占21.83%；酮類10種，占7.96%；醛類8種，占7.94%；酸類5種，占2.83%；烴類4種，占8.34%；雜環2種，占1.39%；萜烯1種，占0.43%。其主要揮發性成分是1-辛烯-3-醇（12.02%）、1-己醇（10.96%）、3-甲基-1-丁醇（10.78%）、苯乙醇（5.18%）及酯類。

在超凡酵母發酵后的豆粕中，共有52種揮發性成分。其中，醇類12種，占49.54%；酯類13種，占20.86%；酮類7種，占8.66%；醛類7種，占9.18%；酸類6種，占3.14%；烴類4種，占6.95%；雜環2種，占1.22%；萜烯1種，占0.45%。其主要揮發性成分是1-己醇（11.24%）、1-辛烯-3-醇（10.28%）、3-甲基-1-丁醇（9.92%）、苯乙醇（4.99%）及酯類。

發酵前后豆粕中揮發性成分按種類的含量分析，結果見圖4。

圖4 發酵前后豆粕中揮發性成分的含量分析Fig.4 Contents analysis of volatile compounds in soybean meal before and after fermentation

由圖4可知，在發酵的過程中，由于酵母經歷新陳代謝，豆粕的主要風味化學成分含量在發酵前后發生了很大的變化，同時還生成了許多新的揮發性化合物，從而形成了豆粕發酵后的特殊的風味。對于醇類化合物來說，4種酵母發酵后，醇類化合物的種類有所上升，但是總體相對含量卻下降。異味物質1-辛烯-3-醇發酵前的相對含量為34.03%，發酵后降幅超過50%，最低降至10.28%，這個結果可為豆類產品脫除異味提供參考依據。1-己醇具有酒香、果香，發酵后相對含量有所降低，但是變化不大。苯乙醇具有玫瑰香的風味，在未發酵的豆粕中相對含量極低，但是經過酵母發酵后，其相對含量最高升至9.26%。在酵母細胞中，苯乙醇可以經苯丙酮酸途徑從頭合成，也可以經過Ehrlich途徑將L-苯丙氨酸轉化生成[16]。另外，3-甲基-1-丁醇、1-壬醇和1-辛醇在未發酵的豆粕中未檢測出，而在發酵產物中大量出現了，其中3-甲基-1-丁醇具有蘋果白蘭地香氣，相對含量占9%以上，構成了發酵產物的主體風味物質。在酵母的發酵過程中，丙酮酸通過一系列的酶促反應合成纈氨酸，纈氨酸再經過Ehrlich途徑最終生成3-甲基-1-丁醇，3-甲基-1-丁醇還可以由亮氨酸直接經過Ehrlich途徑轉化而成[17]。對于酯類化合物，經4種酵母分別發酵后酯的種類均增加了1倍以上，除了安琪酵母發酵后酯類的相對含量有所降低外，馬利、舒可曼、超凡酵母發酵產物的酯類化合物的相對含量均升高。如具有椰子香氣的γ-壬內酯的相對含量從發酵前的2.51%，最高升至4.38%；具有水果香味的乙酸己酯、甜酒香的辛酸乙酯、菠蘿香的己酸乙酯、椰子香的癸酸乙酯、玫瑰花香的乙酸苯乙酯為發酵后新增加的酯。經過4種酵母的分別發酵后，豆粕中醛類化合物的相對含量由發酵前的10.47%降至10%以下，醛類化合物不構成發酵產物的主體風味化學成分，其中具有油脂氣味的壬醛和具有脂肪氣味的（E）-2-辛烯醛的相對含量均有明顯下降。發酵后，豆粕主要異味成分的含量下降明顯，說明發酵法對于豆粕的異味脫除效果顯著。目前已有一些關于酵母發酵法脫除異味的應用被報道，如大豆分離蛋白的異味脫除[18]、豪豬肝的異味脫除[19]，而且包括1-辛烯-3-醇在內的異味化學成分的含量在發酵后均明顯下降。酵母發酵脫除異味的機理至今還不太清楚，可能是異味成分被酵母在新陳代謝的過程中轉化為其他風味良好的成分；另外，酵母含有復雜的胞內酶和胞外酶系統，一些酶可以催化異味化學成分改變其化學結構，從而去除異味。

2.3 豆粕發酵產物的揮發性成分主成分分析

主成分分析（PCA）是統計學上處理降維的一種方法，將原先的變量重新組合成一組新的互相無關的幾個綜合變量，并根據需求從中取出幾個較少的綜合變量盡可能多地反映原來變量。通過初步篩選并按照剔除原則[20]，利用Matlab 2016b對4種不同酵母發酵豆粕的揮發性化學成分進行主成分分析，結果見表2。

表2 三個主因子的特征值和方差貢獻率Table 2 Eigenvalue and variance contribution rate of three principal factors

由表2可知，前2個主因子對方差的累計貢獻率達到了86.13%，這說明前2個主因子能夠較好地反映原始數據的基本信息。第1個主因子F1解釋了總變異信息的52.04%。

酵母發酵豆粕后的揮發性成分經主成分分析后的前兩個主因子的得分圖見圖5，豆粕經不同酵母發酵后經主成分分析后的前兩個主因子得分圖見圖6。

圖5 揮發性成分的主成分散點圖Fig.5 PCA scatter diagram of volatile compounds

由圖5可知，乙酸己酯、1-辛烯-3-醇乙酸酯、苯乙烯、（E）-2-辛烯醛、1-己醇和己酸乙酯在F1上載荷值接近并呈正向分布，十四酸、苯乙醇、9-十六碳烯酸乙酯、1-辛醇、乙酸苯乙酯、苯甲醛、辛酸和2-苯基巴豆醛在F1上載荷值接近并呈反向分布。1-壬醇、乙酸、γ-壬內酯和（Z）-3-壬烯-1-醇在F2上的載荷值接近并呈正向分布，正十六烷、壬酸乙酯和2,3-丁二醇在F2上的載荷值接近并呈反向分布。而按類別，酯類揮發性成分對F1的貢獻率最大，醇類對F2的貢獻率最大。

圖6 不同酵母發酵豆粕的主成分散點圖Fig.6 PCA scatter diagram of fermented soybean meal by different yeasts

由圖6可知，不同酵母發酵豆粕后的揮發性成分有所差異，超凡酵母和舒可曼酵母在主成分散點圖上距離較近，而與其他兩種酵母的距離較遠，說明三者風味可能差異較大。超凡酵母和舒可曼酵母在F1上的得分較高，酯類化合物含量相對較高；馬利酵母在F2上的得分較高，醇類化合物含量相對較高，這與前面的結論基本一致。

3 結論

本研究采用HS-SPME與GC-MS結合，分析了豆粕的揮發性化學成分和4種不同品牌的干酵母發酵豆粕后的揮發性化學成分。在豆粕中共檢測出了36種揮發性成分，主要成分為1-辛烯-3-醇、1-己醇、酯類化合物和醛類化合物，1-辛烯-3-醇為主要的異味成分，占34.03%。經過4種干酵母發酵豆粕后，發酵產物中檢出的揮發性成分分別有54種（安琪酵母）、51種（馬利酵母）、57種（舒可曼酵母）、52種（超凡酵母）。四種發酵產物的主要揮發性成分一致，為1-辛烯-3-醇、3-甲基-1-丁醇、1-己醇、苯乙醇和酯類；安琪酵母和馬利酵母發酵豆粕的酮類揮發性成分種類明顯少于其他兩種酵母；作為主要異味成分的1-辛烯-3-醇的相對含量與發酵前相比下降明顯，降幅為超過50%，其中超凡酵母發酵后含量降幅最大，降至10.28%。主成分分析法對GC-MS采集到的數據進行分析，結果表明超凡酵母和舒可曼酵母發酵豆粕的揮發性化學成分相對含量相近，特別是這兩種酵母發酵豆粕的醇類和酯類揮發物成分總的相對含量相近，與其它兩種酵母發酵后的豆粕差異明顯。發酵菌劑的不同，發酵產物的風味成分也有一定的區別，因此研究不同酵母對豆粕發酵后產物的揮發性成分，可為改良豆粕及相關產品的風味提供理論依據。

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