復合乳酸菌發酵懷山藥工藝及其抗氧化活性

鄭 苗，何 佳*，呂丹丹，宋文華，張雪雯

（河南科技大學 食品與生物工程學院 洛陽市微生物發酵工程技術研究中心 河南科技大學微生物資源開發與利用重點實驗室，河南 洛陽 471023）

懷山藥（Dioscorea opposita）是產自于河南焦作地區的道地的名貴中藥材，藥食同源[1]，口感極佳，曾于2006年獲國家質檢總局批準實施地理標志產品保護[2]。懷山藥又被稱為薯蕷、懷參、山芋等，位居“四大懷藥”之首，被國外譽為“中國人參”[3]。懷山藥中含有豐富的營養物質，包括淀粉、多糖、蛋白質、維生素、淀粉酶等[4]，以及膽堿、尿囊素、糖蛋白、皂苷、植酸、多巴胺、粗纖維、山藥素、甘露聚糖等活性成分，具有預防心腦血管疾病[5-6]，提高機體免疫力[7-8]，調節腸道功能、助消化，健脾補肺[9]，降血糖降血脂[10]，抗衰老抗腫瘤[11-12]等功能。乳酸菌具有腸道黏附率高，定植能力強，調節腸道菌群，降低膽固醇，緩解乳糖不耐癥以及分泌抗生素類物質（細菌素），提高機體免疫力和抗癌等益生作用[13-14]。

當前，乳酸菌發酵食品已成為熱點[15-20]，薯類乳酸菌發酵也進入了人們的研究視野[21-25]，但以純山藥為原料，多種益生乳酸菌復合發酵尚未見報道，本試驗在前期試驗的基礎上，以四株乳酸菌為復合乳酸菌，對純懷山藥酶解液的發酵工藝進行優化并對其產物的抗氧化活性進行了研究，以期為懷山藥資源的深加工和綜合利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷山藥：河南大張實業有限公司；高溫α-淀粉酶（食品級、40 000 U/g）、果膠酶（食品級、20 000 U/g）：江蘇銳陽生物科技有限公司；糖化酶（食品級、100 000 U/g）：上海藍季生物有限公司；檸檬酸（食品級）：河南興源化工產品有限公司；復合乳酸菌[植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（HZLp-005）∶干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）（HZLc-017）∶鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）（HZLr-023）∶嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）（HZLa-008）=0.619%∶0.670%∶0.835%∶0.876%]：本實驗室保藏；VC（分析純）：江蘇強盛功能化學股份有限公司；無水CaCl2、NaOH、FeSO4、H2O2、水楊酸、鄰苯三酚、無水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、K3[Fe（CN）6]、FeCl3（均為分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司；Tris-HCl（分析純）：南京奧多福尼生物科技有限公司；濃鹽酸（分析純）：洛陽昊華化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基（色譜純）：上海藍季生物有限公司；三氯乙酸（分析純）：上海山浦化工有限公司；MRS培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；PHS-25 pH計：上海精密科學儀器有限公司；101-2ES電熱鼓風干燥箱：北京市永光明醫療儀器公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；SPX-250生化培養箱：北京市永光明醫療儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 懷山藥酶解液制備

鮮懷山藥→清洗→80℃漂燙10 min→去皮→切片（3～5 mm厚）→護色（0.3%抗壞血酸、0.4%檸檬酸、0.7%氯化鈣）→去離子水沖洗兩遍→加入5倍質量的去離子水打漿→調pH至6.5，加入占原料質量分數為0.08%的高溫α-淀粉酶，85℃酶解1h→降溫至55℃，加入原料質量分數0.16%的果膠酶和0.09%的糖化酶，酶解3 h（酶解液中還原糖量為5.8%）→115℃滅菌20 min。

1.3.2 菌種活化

分別從斜面上刮取2環復合乳酸菌接種于MRS液體培養基中，于37℃培養18～24 h，以一定的接種量接種到懷山藥酶解液中，傳代2～3次，至活菌數達到1×108以上。

1.3.3 復合乳酸菌發酵懷山藥工藝條件優化

（1）單因素試驗

分別考察發酵時間（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）、發酵溫度（29℃、33℃、37℃、41℃、45℃）、復合乳酸菌接種量（1%、2%、3%、4%、5%）對乳酸產量的影響，每個處理重復3次，確定復合乳酸菌發酵懷山藥的最佳條件范圍。

（2）響應面試驗

表1 懷山藥發酵工藝條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of Chinese yam

依據Box-Behnken設計原理，利用響應面法優化復合乳酸菌發酵懷山藥的工藝條件。在單因素試驗結果的基礎上，以發酵時間（A）、發酵溫度（B）和接種量（C）為變量，以發酵液中的乳酸含量（Y）為響應值優化復合乳酸菌發酵懷山藥的工藝條件。響應面試驗因素水平編碼見表1。

1.3.4 抗氧化活性比較

按照參考文獻[27-30]的方法，以0.05 g/L維生素C（vitamin C，VC）為對照，考察懷山藥酶解液發酵前、后的抗氧化活性。

1.3.5 測定方法

乳酸含量：GB 5413.34—2010《乳和乳制品中酸度的測定》方法[26]。

羥基自由基清除率測定：水楊酸法[27]；超氧自由基清除率測定：按照參考文獻[28]的方法進行；DPPH自由基清除率測定：按照參考文獻[29]的方法進行；還原力測定：按照參考文獻[30]的方法進行。

2 結果與分析

2.1 復合乳酸菌的單因素試驗

2.1.1 發酵時間對乳酸含量的影響

圖1 發酵時間對乳酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on lactic acid content

由圖1可知，發酵液中的乳酸含量隨時間的延長而增加，發酵32 h時乳酸含量達到最大值，為1.53%，延長發酵時間，乳酸含量趨于平穩。這是由于開始時發酵液中的營養物質豐富，乳酸菌大量繁殖，不斷消耗營養物質產生大量的乳酸，產酸量達到最大值后，過酸的條件不利于益生菌的生長，產酸受到抑制，因此，32 h之后產酸量趨于平穩。因而，選取最佳的發酵時間范圍為16～32 h。

2.1.2 發酵溫度對乳酸含量的影響

由圖2可知，發酵液中的乳酸含量隨溫度的升高呈現先上升后平穩的趨勢，在發酵溫度37℃時發酵液中的乳酸含量達到最大值，為1.26%。這是因為溫度較低時，乳酸菌的酶系在溫度較低時活性受到抑制，因而生長受到限制，進而導致產酸量較低，乳酸菌能夠生長的溫度范圍為25～45℃，最適生長溫度為37℃，當溫度升至37℃時，乳酸菌的生長最快，因而產酸量最大。因此，選取最佳的發酵溫度范圍為33～41℃。

圖2 發酵溫度對乳酸含量的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on lactic acid content

2.1.3 接種量對乳酸含量的影響

圖3 接種量對乳酸含量的影響Fig.3 Effect of inoculum on lactic acid content

由圖3可知，發酵液中的乳酸含量隨接種量的增加而呈現先上升后平穩的趨勢。在接種量為5%時，乳酸含量達到最大值，為1.625%。在接種量為1%～3%范圍內，益生乳酸菌的群體生長速度最快。這是因為剛開始發酵液中的營養物質豐富，接種量越大，乳酸菌迅速利用營養物質進行發酵。但是，接種量＞3%后，由于乳酸菌種間存在競爭營養物質用于自身繁殖的現象，一部分菌體在競爭中處于劣勢而死亡，因而乳酸含量會趨于平穩。因而，選取最佳的接種量范圍為2%～4%。

2.2 復合乳酸菌發酵懷山藥工藝條件優化

2.2.1 Box-Behnken試驗設計及結果

以發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）為評價因素，乳酸含量（Y）為評價指標進行響應面試驗，結果見表2。

用Design Expert 8.05軟件對表2的試驗結果進行分析，得到3個影響因素與乳酸含量之間的二次回歸方程：

對該模型進行方差分析，結果如表3所示。

表2 懷山藥發酵工藝條件優化響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of Chinese yam

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，乳酸菌發酵懷山藥工藝的二次模型的F值為82.43，P值＜0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項的P=0.057 1＞0.05，不顯著，說明該模型的擬合度較好。同時，本研究的確定系數R2=0.9907，說明發酵液中乳酸含量結果與該模型的回歸值有很好的一致性，校正系數R2Adj=0.9786＞0.9，說明試驗結果中有97.86%受到所選因素的影響，只有2.14%不受影響。因此，該模型可以用來預測和分析乳酸菌發酵懷山藥過程中乳酸含量。在回歸方程各項方差分析結果表明，各因素對乳酸含量的影響主次為發酵時間（A）＞接種量（C）＞發酵溫度（B），交互項AB對響應值影響極顯著（P＜0.01），交互項BC與AC對響應值影響不顯著（P＞0.05），二次項A2、B2、C2對響應值影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應曲面圖分析

利用Design Expert 8.05軟件對表3中的結果進行二次回歸擬合得出的響應曲面和等高線如圖4所示。由圖4可以看出，隨著發酵溫度的升高，發酵液中的乳酸含量先上升后平穩，隨著發酵時間的延長，乳酸產量先升高后下降，從等高線圖可以清晰地看出，發酵溫度所對應的等高線更陡，說明相對于發酵時間來說，發酵溫度的影響更為顯著；隨接種量的增加，乳酸產量先上升后趨于平穩，接種量所對應的等高線更陡，說明相對于發酵時間來說，接種量的影響更為顯著；隨著發酵時間的延長，乳酸含量先上升后下降，隨著發酵溫度的升高，乳酸含量先上升后平穩，從等高線上可以看出，接種量對應的等高線更陡，說明相對于發酵溫度來說，接種量的影響更為顯著。

圖4 發酵時間、發酵溫度及接種量交互作用對乳酸含量影響的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,temperature and inoculum on lactic acid content

2.2.3 驗證試驗

根據Box-Behnken試驗設計所得結果和二次多項式方程，利用Design-Expert8.05軟件計算出最佳發酵工藝條件，乳酸菌發酵懷山藥的最佳工藝條件為：發酵時間22.83 h、發酵溫度37.64℃、接種量2.8%，在此條件下發酵液中的乳酸含量為1.437%。為了便于操作，將以上條件參數修正為發酵時間23 h、發酵溫度38℃、接種量3%。根據修正的工藝條件，經過5次驗證試驗，發酵液中的乳酸含量可達到1.42%，與理論值相比，降低了0.017%，可見該模型較好的預測了試驗結果。

2.3 抗氧化活性

圖5 懷山藥發酵前后與VC的抗氧化性比較Fig.5 Comparison of antioxidant activity of VC and Chinese yam before and after fermentation

由圖5可知，懷山藥發酵前后的羥基自由基清除率分別為99.55%和99.95%，而VC為54.28%，說明懷山藥酶解液及酶解發酵液具有較高的清除羥基自由基的能力；懷山藥在發酵前對超氧自由基的清除率較低，為15.76%，而經過乳酸菌發酵后的懷山藥對超氧自由基的清除率達94.45%，為發酵前的6倍，且高于VC；懷山藥發酵前后對DPPH自由基的清除率分別為73.85%和89.65%，均高于VC（51.39%）；發酵前懷山藥的還原能力與0.05 g/L VC的還原能力相近，發酵后的懷山藥還原能力提高了0.085，高于VC。

3結論

本試驗通過單因素及響應面試驗優化了復合乳酸菌發酵懷山藥的工藝條件。最終確定最佳的發酵工藝條件為發酵時間23 h、發酵溫度38℃、接種量為3%，在此條件下發酵液中的乳酸含量可達到1.42%。

懷山藥酶解發酵液對羥基自由基、超氧自由基、DPPH自由基清除率分別為99.95%、94.45%、89.65%，較發酵前均有不同程度的提高；還原力提高了0.085。

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