響應(yīng)面法優(yōu)化鹽堿土中所得一株細(xì)菌的培養(yǎng)條件

曹 禮，張學(xué)虹，趙惠蓉，孫銘悅，張 艷，張曉梅，張 耐，李得芳

（1.河西學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅 張掖 734000；2.河西學(xué)院 甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室，甘肅 張掖 734000）

土壤鹽漬化是21世紀(jì)人類面臨的十分突出的問題，全球鹽漬化土地以每年（1.0～1.5）×106hm2的速度在增長[1]。土壤鹽漬化直接危害農(nóng)作物生長，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)減產(chǎn)，降低土地生產(chǎn)力，嚴(yán)重影響和限制現(xiàn)有土壤資源利用和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展[2]，是世界上許多干旱和半干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)產(chǎn)量下降的主要原因[3-4]。鹽漬化土地在全球范圍分布廣泛，由于其土壤質(zhì)量差、作物產(chǎn)量低，已成為土壤退化中的世界性難題[5]。我國西部地區(qū)屬于干旱和半干旱地區(qū)，由于自然和人為因素的作用，鹽漬化土地面積逐年增加，鹽漬化程度不斷加深，已嚴(yán)重影響到國民經(jīng)濟、社會發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展[6-7]。

土壤微生物在物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息傳遞等方面發(fā)揮著重要作用，它們在土壤中的分布特征反映了植物營養(yǎng)與土壤肥力狀況之間的關(guān)系[8]。微生物種群結(jié)構(gòu)的多樣性、穩(wěn)定性和種群恢復(fù)性在維護土壤生態(tài)系統(tǒng)的有效性中起著關(guān)鍵作用[9-10]。土壤微生物和地上植被是相輔相成、不可分割的整體，它們互相影響、互相制約，為生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和穩(wěn)定性提供有利條件[11]。土壤微生物數(shù)量及微生物多樣性可以作為鹽漬化土壤質(zhì)量恢復(fù)及評價的生物指標(biāo)[12]。改良與開發(fā)鹽漬化土地以及防治土壤的次生漬化，己成為實現(xiàn)土地資源可持續(xù)利用和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要方面[13]。本研究以張掖鹽漬化土壤中篩選得到的菌株HX-6作為研究對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析探討菌株HX-6的最適生長條件，以期為鹽漬化土壤的修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

節(jié)桿菌（Arthrobactersp.）HX-6：從甘肅張掖鹽漬化土壤中篩選所得，實驗室保藏；試驗中所用到的試劑均為分析純，購自上海生工生物工程有限公司。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉8.0 g/L，pH 7.0；

無氯化鈉LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，pH 7.0。固體培養(yǎng)基在上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入瓊脂粉，使其質(zhì)量濃度為15 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-X400恒溫振蕩培養(yǎng)箱：太倉市華美生化儀器廠；SWCJ-1超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備；FA2004B電子分析天平：上海天平儀器廠；SC-02離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；722s分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養(yǎng)和種子液的制備

將-70℃冷凍保藏的菌株HX-6劃線接種于LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，于30℃、150 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌2次，加入無菌水重新懸浮菌體，調(diào)節(jié)OD600nm值至1.5，作為種子液，按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量將種子液接入相應(yīng)的培養(yǎng)基中。

1.3.2 不同pH對菌株HX-6生長的影響

培養(yǎng)液中pH值的維持使用不同的液體緩沖液體系，以測定不同pH值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0）對菌株HX-6生長的影響。當(dāng)pH值為5.0～8.5時，選擇用磷酸鹽緩沖體系；當(dāng)pH值為9.0時，選擇用碳酸鹽緩沖體系。試驗中20 mL培養(yǎng)基含18 mL的緩沖液體系和2 mL LB液體培養(yǎng)基，將種子液以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種到液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)72 h，在波長600 nm處測其吸光度值（即OD600nm）。每個試驗設(shè)置3個平行試驗，設(shè)不接種任何微生物的樣品為空白對照，最終數(shù)值為3個平行數(shù)值的平均值，下同。

1.3.3 不同培養(yǎng)溫度對菌株HX-6生長的影響

配制液體LB培養(yǎng)基至錐形瓶，滅菌后將種子液以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接入其中，在不同的溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃）條件下，150r/min培養(yǎng)22h，在波長600nm處測其吸光度值。

1.3.4 不同氯化鈉含量對菌株HX-6生長的影響

錐形瓶中加入液體無氯化鈉的LB培養(yǎng)基，分別加入氯化鈉，使其最終含量分別為0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.0%、5.0%、10.0%，滅菌，然后將種子液以體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種其中，30℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，在波長600 nm處測其吸光度值。

1.3.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果及Box-Behnken設(shè)計原則，3個因素分別以A（pH），B（培養(yǎng)溫度）和C（氯化鈉含量）表示。以單因素試驗結(jié)果的最適條件作為中水平，即0水平[14]，試驗設(shè)計中所用的因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH對菌株HX-6生長的影響

由圖1可知，菌株HX-6在pH值為6.0～7.0范圍內(nèi)生長良好，當(dāng)pH為7.0時，菌株HX-6的生長最好，此時菌懸液OD600nm值最大，為0.76；當(dāng)pH為＜5.5或＞8.0時，菌株HX-6的生長量較低，生長受到嚴(yán)重抑制。因此，菌株HX-6的最適生長pH為7.0。

圖1 不同pH對菌株HX-6生長的影響Fig.1 Effects of different pH on the growth of strain HX-6

2.2 不同培養(yǎng)溫度對菌株HX-6生長的影響

由圖2可知，不同的培養(yǎng)溫度下，菌株HX-6的生長差異顯著。菌株HX-6在30～35℃的范圍內(nèi)生長較好，其中35℃生長最好，此時OD600nm最大為0.46；在培養(yǎng)溫度高于40℃或低于25℃條件下生長量較低，均影響菌株HX-6的生長。因此，菌株HX-6的最適培養(yǎng)溫度為35℃。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對菌株HX-6生長的影響Fig.2 Effects of different culture temperature on the growth of strain HX-6

表1 菌株HX-6培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for strain HX-6 culture conditions optimization

2.3 不同氯化鈉含量對菌株HX-6生長的影響

由圖3可知，氯化鈉含量較低時對菌株HX-6生長有明顯的促進作用，當(dāng)氯化鈉含量為0.1%～0.5%時，相對于不加氯化鈉的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)相同時間后菌株HX-6生長量（OD600nm值）有所增加。當(dāng)氯化鈉含量為0.5%時菌株HX-6生長量最大，OD600nm值為1.56；當(dāng)LB培養(yǎng)基中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞1%時，菌株HX-6的生長明顯被抑制，但當(dāng)LB培養(yǎng)基中NaCl含量為10%時，菌株HX-6依然可以生長，在相同培養(yǎng)時間生長量較低，這說明菌株HX-6最適生長的氯化鈉含量為0.5%，但可以耐受培養(yǎng)基中含量為10%的NaCl。

圖3 不同氯化鈉含量對菌株HX-6生長的影響Fig.3 Effects of different sodium chloride concentration on the growth of strain HX-6

2.4 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原則和單因素試驗的結(jié)果，以A（pH）、B（溫度）、C（氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為主要考察因素，進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，150r/min振蕩培養(yǎng)11h后，以波長600nm處細(xì)菌懸液的吸光度值（Y）為考察指標(biāo)，設(shè)計3因素3水平（共17個試驗點，6個中心點）的響應(yīng)面試驗[15]，每組試驗重復(fù)3次，取其平均值，試驗設(shè)計情況及其結(jié)果如表2所示。

表2 菌株HX-6培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for strain HX-6 culture conditions optimization

經(jīng)過擬合后得到菌株的生長量（OD600nm值）關(guān)于三個考察因素（pH、溫度和氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的回歸方程為：

本研究在Box-Behnken試驗設(shè)計中涉及到17組試驗點，可分為析因點和零點，其中析因點為自變量的取值在A、B、C三個考察因素所構(gòu)成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，中心試驗組重復(fù)5次，用以估計試驗誤差。將17組試驗點按要求試驗后將其結(jié)果輸入到相應(yīng)位置后，采用響應(yīng)面分析軟件中Design-Expert8.05程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進行分析處理，結(jié)果如表3。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

所得模型P值＜0.0001，說明本試驗所建立的模型極顯著（P＜0.01），不同處理間的差異極顯著（P＜0.01）。模型失擬項的P值為0.0598，說明模型失擬項不顯著（P＞0.05）。一次項A、B、A2、B2、C2對模型的影響極顯著（P＜0.01）。一次項C對菌株HX-6的生長影響顯著（P＜0.05）。模型決定系數(shù)R2為98.74%，表明pH、培養(yǎng)溫度和氯化鈉含量對菌體生長的影響占98.74%，說明該模型的相關(guān)度較好，可用于該菌株最適生長條件的優(yōu)化。

2.5 二因子互作效應(yīng)分析

將試驗中所考察3個因素的其中一個因素固定于零水平，用DPS軟件制作出響應(yīng)曲面圖，以研究另外兩個因素間的交互效應(yīng)，結(jié)果見圖4。交互作用的強弱可以通過等高線的形狀來反映，橢圓形表示兩因素間交互作用顯著，而圓形則表示兩因素間交互作用不顯著。由圖4可知，隨著各交互因子編碼值的升高，OD600nm值呈上升趨勢，但當(dāng)編碼值達到一定的組合后呈下降的趨勢。結(jié)果顯示，兩兩交互作用顯著，其中pH值和溫度交互作用更為顯著。

圖4 pH、培養(yǎng)溫度及NaCl含量交互作用對菌懸液吸光度值影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour line of the interaction between pH,temperature and NaCl concentration on the absorbance value of bacterial suspension

通過統(tǒng)計軟件Design Expert 8.0.5的優(yōu)化，得到菌株HX-6生長的最適條件為：pH值為6.95，培養(yǎng)溫度33.79℃，培養(yǎng)環(huán)境中氯化鈉含量為0.52%，此條件下的OD600nm值預(yù)測值為0.42。由于考慮到實際操作的可行性，將菌株HX-6的最適培養(yǎng)條件修正為pH值為7.0，培養(yǎng)溫度34℃，培養(yǎng)基中氯化鈉含量為0.5%。為了驗證所建立模型優(yōu)化結(jié)果的可靠性，采用修正后的工藝參數(shù)進行3次平行試驗，150r/min振蕩培養(yǎng)11 h后，菌株HX-6在波長600 nm處菌懸液的吸光值（OD600nm）平均為0.43，與理論預(yù)測值相近，表明建立的數(shù)學(xué)模型對菌株HX-6培養(yǎng)條件的優(yōu)化具有實際應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

響應(yīng)面法試驗設(shè)計方法是一種綜合試驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，通過分析不同因素間的交互作用，以達到較全面地反映試驗中各因素和水平的效果，回歸擬合全局范圍內(nèi)因素與結(jié)果之間的函數(shù)關(guān)系，并且取得各因素最優(yōu)水平值[16]；克服了正交試驗設(shè)計只能處理離散的水平值而無法找出整個區(qū)域中因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，同時也有效減少了試驗次數(shù)[17-18]。本試驗通過響應(yīng)面試驗設(shè)計和分析，結(jié)果顯示，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)環(huán)境中的pH值、培養(yǎng)液中氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)這3個因素對菌株HX-6的生長影響都顯著，不是簡單的線性關(guān)系。同時，也建立了影響菌株生長的關(guān)鍵因素的二次多項回歸方程模型，此模型在試驗范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確的預(yù)測菌株HX-6的最適培養(yǎng)條件，得到其最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH值7.0，培養(yǎng)溫度34℃，培養(yǎng)基中NaCl含量0.5%。在此條件下培養(yǎng)11 h后，菌株HX-6菌懸液在波長600 nm處的吸光度值為0.43，其生長量與預(yù)測生長量相差無幾，表明響應(yīng)面分析法可有效用于細(xì)菌菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

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