一株產(chǎn)α-淀粉酶菌株的分離篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

趙淑琴，楊孝樸

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，種類繁多，按水解產(chǎn)物異構(gòu)類型的差異可將淀粉酶分為α-淀粉酶和β-淀粉酶，其中α-淀粉酶應(yīng)用最為廣泛。淀粉酶是迄今為止最早實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)酶、產(chǎn)量最大、使用用途最廣的酶制劑品種[1]，目前大多以微生物發(fā)酵法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[2]。淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、淀粉糖漿、傳統(tǒng)釀造、紡織業(yè)、青儲飼料、醫(yī)藥等行業(yè)[3-4]。然而，在工業(yè)生產(chǎn)過程中的高溫、酸堿度和重金屬離子等苛刻的使用環(huán)境中，淀粉酶的穩(wěn)定性會迅速下降，酶的活力也會損失較快或完全喪失，使用壽命及效率也會隨之降低，從而使淀粉酶的應(yīng)用范圍縮小，阻礙了淀粉酶的應(yīng)用與發(fā)展。由于我國淀粉資源豐富，淀粉酶的應(yīng)用范圍廣泛，淀粉酶工業(yè)發(fā)展與我國其他工業(yè)的發(fā)展有著緊密的聯(lián)系，推動淀粉酶工業(yè)的發(fā)展，也將推動我國其他工業(yè)的共同發(fā)展[5]。因此，進(jìn)一步擴(kuò)大對淀粉酶的產(chǎn)量和品種研究，開發(fā)具有高穩(wěn)定性的淀粉酶以更好的適應(yīng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展需要[6]，使淀粉酶可以適應(yīng)高溫、強酸堿等苛刻的工業(yè)環(huán)境條件[7]，是近年來待解決的重要課題[8]。

近年來，國內(nèi)外許多學(xué)者對淀粉酶的開展了大量的研究。劉金嵐等[9]以大腸-枯草穿梭載體pMA5質(zhì)粒為骨架，以嗜熱脂肪地芽孢桿菌（Geobacillus stearothermophilus）NUB3621的耐高溫α-淀粉酶基因為目的基因，利用重疊延伸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（prolonged overlap extension polymerase chain reaction，POE-PCR）成功構(gòu)建了針對淀粉酶的信號肽篩選載體。楊韻霏等[10-11]通過木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)成功實現(xiàn)地衣芽孢桿菌麥芽糖淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的高效異源表達(dá)，并對重組枯草芽孢桿菌的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，酶活最高達(dá)到296.64U/mL發(fā)酵液，從而提高麥芽糖淀粉酶在工業(yè)中的應(yīng)用。因此，該研究從富含淀粉的地方采集土樣進(jìn)行試驗，以期獲得在某些方面性能優(yōu)良（如耐高溫、耐強酸、耐強堿等）的α-淀粉酶生產(chǎn)菌，從而為將來改良α-淀粉酶生產(chǎn)菌，以及滿足不同行業(yè)的需要奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：學(xué)校周邊、奶牛場及校內(nèi)食堂垃圾附近富含淀粉的土壤；十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒：北京索萊寶科技公司，纖維系DE-52：英國Whatman公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（14.4～97.4 kDa）：大連TAKARA公司；葡聚糖凝膠G-50、葡聚糖凝膠G-150：上海維塔化學(xué)試劑有限公司；商品α-淀粉酶（枯草芽孢桿菌所產(chǎn)，純度93%）：北京酷來博科技公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：蘇州恒程化工科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TG1850-WS高速臺式低溫離心機(jī)：盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JY-E型電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-系列超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZHWY-100B多振幅軌道搖床：鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司；BWS-系列恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WFH-203紫外檢測儀：上海青浦滬西儀器廠；CXG-1電腦恒溫層析柜：上海青浦滬西儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集

從學(xué)校周邊、奶牛場及校內(nèi)食堂垃圾附近的土壤中將采集的樣品裝入樣品袋中，并標(biāo)記時間和地點。

1.3.2 培養(yǎng)基的制備

平板分離培養(yǎng)基[13]：可溶性淀粉10.00 g、NaCl 5.04 g、瓊脂粉15.00g、蛋白胨10.00 g、蒸餾水1 000 mL，pH值自然，121℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉10.00 g、KH2PO43.06 g、CaCl20.21g、（NH4）2SO42.50g、蛋白胨5.00g、蒸餾水1000mL，pH值自然，121℃滅菌20 min。

1.3.3 菌株的篩選

平板初篩：稱取10g采集樣品，放入錐形瓶中傾入100mL無菌水中，放入恒溫?fù)u床中37℃、120 r/min培養(yǎng)24 h后，用移液槍吸取1 mL并稀釋至10-6，從稀釋液中吸取20～50 μL涂平板，將涂好的平板在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24 h后，挑選透明圈圈徑比較大的菌落并標(biāo)記備用[13-14]。

平板復(fù)篩：根據(jù)初篩平板上菌落的形狀大小、顏色及是否產(chǎn)淀粉酶的特性，將初篩后的各種菌種分別接種在復(fù)篩平板上，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24h。挑選透明圈較大的單菌落進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。

搖瓶復(fù)篩：平板復(fù)篩挑選出的單菌落進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，以120mL/250mL的裝液條件下，在恒溫?fù)u床內(nèi)37℃、120r/min培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液離心（8 000 r/min、10 min）后，取上清液測定酶活[15]。

1.3.4 菌種的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察：通過平板培養(yǎng)和穿刺接種法培養(yǎng)篩選出的菌株，觀察其菌落形態(tài)和運動能力，再挑取平板培養(yǎng)的單個菌落，通過革蘭氏染色將其分為革蘭氏陽性菌G+和革蘭氏陰性菌G-；通過孔雀綠芽孢染色后，觀察該菌是否產(chǎn)生芽孢。

（2）菌株主要生理生化研究：篩選出劃線培養(yǎng)24 h后的菌種，然后挑取單菌落，進(jìn)行細(xì)菌的硝酸鹽還原試驗、甲基紅試驗、接觸酶試驗（過氧化氫酶試驗）、檸檬酸鹽試驗、硫化氫試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、氧化酶試驗、精氨酸水解試驗[16]。

（3）分子生物學(xué)鑒定：16S rDNA序列分析[17]：將提取的菌株總DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。細(xì)菌專一性16SrDNA引物由TaKaRa公司合成，其正向引物（27f）：5′-AGTTTGATCCTGGTCAG-3′，反向引物（1492r）：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；16S rDNA PCR反應(yīng)體系正向引物2 μL，反向引物2 μL，模板DNA4 μL，Primer star MAX 25 μL，ddH2O 17 μL。擴(kuò)增過程為：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s；55～65 ℃、30 s；72 ℃、2 min；共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為：電壓110 V，電泳30～45 min。用上海生工的膠回收試劑盒進(jìn)行16S rDNA PCR產(chǎn)物純化。經(jīng)純化后，送與北京天一輝遠(yuǎn)公司完成測序。然后在NCBI中進(jìn)行BIAST同源性比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹初步鑒定菌株LZ-1。

（4）gyrB基因序列擴(kuò)增鑒定：湯際亮等[18]報道，單獨分析16S rDNA序列無法區(qū)分解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌這樣親緣關(guān)系很近的菌種。因此，采用gyrB序列分析法進(jìn)一步鑒定。gyrB基因通用引物序列：上游引物：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，下游引物：5′-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCN GT CAT-3′；其中Y、N、R表示兼并堿基，Y表示C或T，N表示A、T、C或G，R表示A或G。

PCR反應(yīng)條件：96℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收并送與北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測序，然后在NCBI中進(jìn)行BLAST的序列同源性比對進(jìn)一步分析鑒定。

1.3.5 酶活力的測定

淀粉酶酶活力的測定[19]：采用3,5-二硝基水楊酸法測定酶活力（以麥芽糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線），以商品α-淀粉酶作為對照，測定實驗菌株在波長520 nm處的光密度值，比較兩者的酶活力。酶活力單位定義：在40℃、pH=6.0條件下，每分鐘從1 mL 1%的可溶性淀粉中釋放出1 mmol麥芽糖的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。

1.3.6 粗酶液的分離純化

硫酸銨沉淀法：發(fā)酵原液離心得上清液，緩慢加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末至30%飽和度，于冰箱（4℃）中放置過夜，10 000 r/min離心10 min，調(diào)節(jié)pH值，其主要的方法是加入氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)，然后測定上清和沉淀中的淀粉酶活性和比活力。再在上清中緩慢加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末至65%飽和度，于冰箱（4℃）中放置過夜，離心機(jī)中10 000 r/min離心10min后去除上清收集沉淀，隨后用蒸餾水溶解沉淀，透析除鹽后粗酶液測定淀粉酶活力和比活力[20]。

凝膠過濾層析：用Sephadex G-50（柱床1.5 cm×20 cm）進(jìn)行脫鹽和Sephadex G-100（柱床1.5 cm×60 cm）分離蛋白質(zhì)，加蒸餾水處理葡萄糖凝膠，使其溶脹24 h，溶脹后經(jīng)反復(fù)沖洗，將上清中的細(xì)小顆粒棄掉，直到澄清[8]。進(jìn)行裝柱，用0.02 mol/L醋酸緩沖液（pH 7.0）平衡后上樣，上樣量為柱床體積的5%，然后進(jìn)行分離蛋白的監(jiān)測與收集，根據(jù)電腦上顯示的蛋白峰對應(yīng)的收集管測定Sephadex G-100純化液淀粉酶活力，將有酶活力的收集管集中在一起在聚乙二醇上進(jìn)行濃縮，使其體積為3 mL。

陰離子交換層析：用纖維素DE-52（柱床1.5 cm×80 cm）進(jìn)一步純化蛋白質(zhì)，上樣量為3mL。在pH值為7.0的條件下，用0～1 mol/L的氯化鈉和0.02 mol/L醋酸緩沖液進(jìn)行線形梯度洗脫，自動部分收集器（流速為1mL/min）收集洗脫液，每管3 mL，根據(jù)電腦上顯示的蛋白峰對應(yīng)的收集管測定Celluse DE-52純化液蛋白質(zhì)含量和酶活力，并計算酶的比活力[21-22]。

1.3.7 SDS-PAGE電泳及蛋白分子質(zhì)量測定

將酶活性峰區(qū)域的樣品進(jìn)行合并，適當(dāng)濃縮后通過SDS-PAGE電泳檢測酶純度，并計算其分子質(zhì)量[9]。電泳中所采用的分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（pH值8.3）。加樣后，將電壓調(diào)至80V，大約1 h，等溴酚蘭標(biāo)示的樣品區(qū)域帶降到濃縮膠與分離膠相接觸的地方時，調(diào)整電壓為130 V，待溴酚蘭指示劑距邊緣0.5cm處電泳結(jié)束[10]。然后進(jìn)行染色和脫色，最后測算蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和淀粉酶遷移率，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定淀粉酶分子質(zhì)量。

1.3.8 酶學(xué)性質(zhì)研究

溫度對淀粉酶的影響：取一定量的粗酶液，分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的溫度環(huán)境下測定酶活力[16]。

酶的熱穩(wěn)定性的研究：取一定量的粗酶液，在溫度分別為50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的環(huán)境下保溫30 min、60 min、120 min和180 min后，測定殘余酶活力。

pH值對淀粉酶的影響：取一定量的粗酶液，分別在pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的環(huán)境下測定酶活力。

酶的pH值穩(wěn)定性的研究：取一定量的粗酶液，在pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的環(huán)境下放置30 min、60 min、120 min和180 min后測定殘留酶活力。

1.3.9 金屬離子、EDTA對酶活力的影響

在待測酶液中分別加入多種金屬離子（Ca2+、Mg2+、Na+、K+、Fe2+、Zn2+）及EDTA至終濃度為2 mmol/L，45 ℃處理15 min，測定其酶活值在不同的金屬離子和EDTA的作用下，測定酶活力的大小[17]，每組設(shè)3個平行樣，重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉酶產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

通過對淀粉酶產(chǎn)生菌采用碘熏法在平板上篩選出1種產(chǎn)淀粉酶的菌株，編號為LZ-10，結(jié)果如圖1所示，測定其酶活力值為41.6 U/mL。

圖1 菌株LZ-10的透明圈Fig.1 Transparent circle of strain LZ-10

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果

通過平板培養(yǎng)后觀察菌株LZ-10為白色菌落，菌落不透明，有形狀似小傘的皺褶，由中央凸起向周圍擴(kuò)散，邊緣不整齊，挑起時較粘稠；芽孢可見，兩端鈍圓，直徑約0.5 μm，長約2.0 μm。用孔雀綠芽孢染色后，能清晰看到芽孢，結(jié)果見圖2。對菌株LZ-10進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果如表1所示，菌株LZ-10與文獻(xiàn)[18]報道的解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的生理生化特性非常相近。

圖2 菌株LZ-10革蘭氏染色形態(tài)（A）及孔雀綠芽孢染色形態(tài)（B）（10×100）Fig.2 Morphology of strain LZ-10 after gram staining(A)and after malachite green spore staining(B)

表1 菌株LZ-10的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain LZ-10

2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.3.1 菌株LZ-10的16S rDNA序列分析

圖3 菌株LZ-10的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of 16S rDNA sequence of strain LZ-10

圖4 菌株LZ-10的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of strain LZ-10

菌株LZ-10經(jīng)16S rDNA通用引物PCR擴(kuò)增后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，將電泳后的條帶進(jìn)行膠回收后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。將膠回收后經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物送與北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測序，根據(jù)測得的序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對。結(jié)果表明，菌株LZ-10與特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等的16S rDNA都具有高度相似性，相似度都為99%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4）分析其都處于同一分支，所以通過16S rDNA不能確定該菌。

2.3.2 菌株的gyrB基因序列分析

菌株LZ-10經(jīng)gyrB基因序列擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳后的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，并送與北京天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測序，測序的結(jié)果：CAGTAGAATACGCTAGTA CTGTATCCTGTATGTGGTACGGGCTTTCTCAAGGTTG AAGTCTTCCCCAATACCTGTGCCGAGCGCTGTGATC ATAGAGCGAACTTCGTTGTTAGAAAGGATTTTATCC AGTCTGGCCTTTTCAACGTTTAGGATTTTACCTCTAA GCGGCAAAATGGCTTGGAAATGTCTGTCGCGTCCTT GTTTAGCAGATCCTCCGGCAGAGTCACCCTCTACGA TATATAACTCGGAGATGCTCGGATCTTTTGAAGAGC AGTCCGCTAACTTACCGGGCAGGTTTGAAATTTCCA AAGCACTCTTACGACGTGTTAGTTCACGGGCTTTTTT CGCAGCCATTCTTGCTCTTGCCGCCATTAAGCCTTTA TCGACAATTTTTTTGGCTGCATCTGGATTTTCCAGCA TAAATGTTTCCATCGCCGTAGAAAATAACGTATCGG TGATCGTCCGTGCTTCTGAGTTGCCCAGCTTTGTTTT CGTTTGGCCCTCAAACTGCGGATCAGGGTGTTTGATT GAAATAATCGCTGTCAGCCCTTCCCTTACGTCATCTC CGCTTAGGTTTGGATCATTTTCTTTAATAAGCCCTTT TTTTCTGGCGTAATCGTTGATAACACGAGTCATGCCC GTTCTGATGCCAGCTCCATGCGCACCGCCTTCGTATG TGT。在NCBI中進(jìn)行BLAST序列比對分析其與枯草芽孢桿菌具有99%的同源性，因此鑒定菌株LZ-10為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.4 淀粉酶的純化效果

將發(fā)酵原液用30%硫酸銨沉淀后，上清中酶活力為36.8 U/mL，在沉淀中未檢測出酶活力，故將沉淀棄去，將上清用65%的硫酸銨沉淀后用蒸餾水溶解，脫鹽后發(fā)酵液及各柱層析液中各指標(biāo)的測定結(jié)果見表2。

表2 脫鹽后發(fā)酵液及柱層析液中指標(biāo)的測定結(jié)果Table 2 Determination results of the indexes of fermentation broth after desalination and liquid chromatography

2.5 SDS-PAGE電泳圖譜

對發(fā)酵原液、經(jīng)硫酸銨鹽析后的粗酶液、SephadexG-100純化后的酶液、DEAE-52離子交換層析后濃縮的酶液以及蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS-PAGE電泳（見圖5）。以蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對數(shù)值（Mr）為縱坐標(biāo)，遷移率（x）為橫坐標(biāo)，作出蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程lgMr=-1.2258x+2.3677，計算得到α-淀粉酶的分子質(zhì)量為55.4 kDa，表明獲得了純酶。

圖5 各酶液的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 Electrophoretogram of SDS-PAGE of each enzyme liquid

2.6 酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果

2.6.1 酶的最適作用溫度與熱穩(wěn)定性

考察反應(yīng)溫度對酶活性與酶熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 反應(yīng)溫度對酶活性的影響Fig.6 Effect of reaction temperature on enzyme activity

由圖6可知，酶活性隨著反應(yīng)溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，最適溫度為50℃。由圖7可知，在50℃環(huán)境中保溫180 min后，其酶活力仍在69%以上。在70℃環(huán)境中保溫180 min后，其酶活力仍在45%以上。在90℃條件下保溫30 min后，其酶活力急劇下降為30%左右，熱穩(wěn)定性較差；當(dāng)保溫超過120 min后，喪失酶活力。表明菌株LZ-10所產(chǎn)α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性較高。

圖7 處理溫度和時間對酶活性的影響Fig.7 Effect of treatment temperature and time on enzyme activity

2.6.2 酶的最適pH值與pH穩(wěn)定性

考察不同pH值對酶活力與酶穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 pH對酶活性的影響Fig.8 Effect of pH on enzyme activity

圖9 pH和處理時間對酶活性的影響Fig.9 Effect of pH and treatment time on enzyme activity

由圖8可知，酶活性隨著pH值的升高呈先上升后下降的趨勢，菌株LZ-10的最適pH值為7，表明該酶為中性淀粉酶。由圖9可知，在pH值為7的環(huán)境下穩(wěn)定性較高，保溫180 min后仍具有90%的酶活力。在pH值為6時，保溫180 min后其酶活力下降到79%。在pH值為5環(huán)境下保溫30 min后仍具有80%以上的酶活力；保溫180min后其酶活力下降到65%。當(dāng)pH值為4、8時，保溫180 min后其酶活力下降到40%左右，其穩(wěn)定性較差。故酶的pH值穩(wěn)定范圍為5.0～7.0。

2.6.3 金屬離子、EDTA對酶活力的影響

在不同的金屬離子和EDTA的作用下，測定酶活力的大小，研究金屬離子對酶活力的影響，結(jié)果見圖10。由圖10可知，Ca2+、Mg2+、Na+、K+對該酶有激活作用，EDTA、Fe2+、Zn2+對酶有抑制作用。

圖10 金屬離子和EDTA對酶活力的影響Fig.10 Effect of metal ion and EDTA on enzyme activity

3 結(jié)論

本實驗篩選到的一株產(chǎn)淀粉酶菌株LZ-10，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，生理生化特性檢測，16S rDNA分子鑒定以及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，由于特基拉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌與菌株LZ-10同源性很高，為進(jìn)一步鑒定該菌株，選擇gyrB基因序列擴(kuò)增后測序進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。純化后的淀粉酶比活力為59.91 U/mg，純化倍數(shù)為4.53，回收率為60.5%；α-淀粉酶分子質(zhì)量為55.4 kDa。本實驗篩選的菌株LZ-10產(chǎn)生的淀粉酶，經(jīng)驗證最適作用溫度為50℃，在50～70℃條件下穩(wěn)定性較高；最適pH值為7.0，在pH 5.0～7.0的條件下穩(wěn)定性較高。2 mmol/L的Ca2+、Mg2+、Na+、K+對淀粉酶有激活作用；EDTA、Fe2+、Zn2+對淀粉酶有抑制作用。

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