高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生酵母的篩選及產(chǎn)酶能力差異性分析

王 佳，胡蘭蘭，張軍翔，陳福生，張秀艷*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.寧夏大學(xué) 葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

β-葡萄糖苷酶（又稱β-D-葡萄糖苷水解酶）可以從香氣前體物質(zhì)的末端非還原性β-D-糖苷鍵中釋放出非還原性糖基，增加葡萄酒的香氣成分[1]。研究表明，外源添加β-葡萄糖苷酶可賦予果酒更好的花香、果香、堅果香[2]。β-葡萄糖苷酶廣泛存在于植物、動物、微生物等，然而微生物來源的β-葡萄糖苷酶的活性遠(yuǎn)比植物來源的要高[3]。果酒釀造過程中，不僅釀酒酵母作為重要的微生物存在，研究表明，有些非釀酒酵母中還能夠產(chǎn)生十分豐富的β-葡萄糖苷酶[4-7]，如葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。因此，篩選出高產(chǎn)糖苷酶的酵母成為更多研究的重點(diǎn)。

在果酒發(fā)酵中，釀酒酵母貫穿于整個發(fā)酵過程，但其較低的β-葡萄糖苷酶酶活力是造成果酒風(fēng)味單一的重要原因，進(jìn)而需添加能夠改善果酒風(fēng)味的酵母菌株[8-13]。但是β-葡萄糖苷酶是否廣泛存在于酵母中，且其酶活力是否表現(xiàn)出差異性等，這些問題不得而知。因此，對酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力進(jìn)行差異性分析就顯得十分必要。

本課題組已從寧夏賀蘭山東麓不同地域的9個葡萄莊園和自然發(fā)酵葡萄汁中分離出酵母菌，采用七葉靈顯色法和4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）顯色法對分離的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌能力進(jìn)行篩選，并根據(jù)WL瓊脂培養(yǎng)基上酵母的菌落形態(tài)和26S rDNA D1/D2區(qū)的序列分析對分離的酵母菌進(jìn)行分類鑒定，通過統(tǒng)計學(xué)方法對酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力進(jìn)行差異性分析，以期為后續(xù)篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

酵母菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離和保藏。兩株商業(yè)釀酒酵母作為對照菌株，分別為安琪釀酒酵母（AngelSaccharomyces cerevisiae，ASC）和法國釀酒酵母ACTIFLORES.cerevisiae（FSC）。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptone，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，蒸餾水配制，自然pH，121℃滅菌20 min。

七葉靈培養(yǎng)基：七葉靈0.3%，檸檬酸鐵0.05%，NaCl0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.1%，瓊脂2%，自然pH，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10%，蛋白胨5%，K2HPO41%，MgSO40.5%，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：吐溫-801%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，NH4NO30.3%，KH2PO40.4%，MgSO4·7H2O0.05%，自然pH，121℃滅菌20 min。

WL瓊脂培養(yǎng)基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖5%，瓊脂2%，KH2PO40.055%，KCl 0.042 5%，CaCl20.012 5%，F(xiàn)eCl3·6H2O0.00025%，MgSO4·7H2O0.0125%，MnSO40.00025%，pH值為6.5，121℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（純度98%）：美國Sigma公司；酵母浸粉（分析純）：安琪酵母股份有限公司；對硝基苯酚、葡萄糖、胰蛋白胨、NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4等（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IF超凈工作臺：蘇中凈化設(shè)備有限公司；WD-9413B凝膠成像分析儀、DYY-8C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；T960型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州博日科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的初篩

將YPD培養(yǎng)基中活化好的941株酵母按105CFU/mL接種到含200 μL七葉靈培養(yǎng)基的96孔板中，28℃培養(yǎng)3 d，對照菌株為ASC和FSC，每個菌株做兩個平行。

1.3.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的復(fù)篩

采用p-NPG法分析β-葡萄糖苷酶酶活力，對復(fù)篩酵母菌株進(jìn)行酶活力測定，具體參見王玉霞[14]的方法，酶活力單位定義為：每分鐘生成1μmol對硝基苯酚所需的酶量（U/L）。

1.3.3 酵母菌的形態(tài)鑒定

將所有酵母菌株活化，適當(dāng)稀釋后涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d。挑選單菌落點(diǎn)種在WL瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5 d，記錄菌落顏色和形態(tài)，對酵母菌株進(jìn)行初步分類。

1.3.4 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

酵母菌的DNA提取，26S rDNA D1/D2區(qū)PCR擴(kuò)增，具體條件參見陳杰等[15]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序分析，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的初篩

采用七葉靈顯色法對分離的941株酵母進(jìn)行產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的篩選，部分酵母菌株的初篩結(jié)果見圖1。

圖1 部分酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的初篩結(jié)果Fig.1 Preliminary screening results of partial β-glucosidaseproducing yeasts

根據(jù)七葉靈在β-葡萄糖苷酶的作用下生成的七葉苷原與Fe3+形成棕黑色的復(fù)合物，且顏色越深則酶活力越高的原理[16]，將酵母菌株分為高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株（黑色）、中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株（深灰色）、低產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株（淺灰色）、不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株（白色）[17]。

由圖1可知，941株酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力具有差異性，其中154株酵母高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶與對照菌株FSC和ASC產(chǎn)酶能力相同，占16.4%；787株酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力比對照菌株ASC和FSC低，其中112株酵母中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，占11.9%；258株酵母低產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，占27.4%；417株酵母不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，占44.3%。

2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的復(fù)篩

2.2.1 p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

通過分光光度計測定不同濃度的對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，以對硝基苯酚濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在0～0.09μmol/mL范圍內(nèi)，得回歸方程y=12.622x+0.017 6，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，說明對硝基苯酚在0～0.09 μmol/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性相關(guān)，從而通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶活力。

圖2 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of p-nitrophenol

2.2.2 復(fù)篩酵母菌株的β-葡萄糖苷酶酶活力分析

表2 部分復(fù)篩酵母菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酶活力分析Table 2 Enzyme activity analysis of β-glycosidase by partial second screening yeasts

由表2可知，以菌株FSC（76.08U/L）和ASC（41.12U/L）的β-葡萄糖苷酶酶活力為對照，篩選出4株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株，分別為SLY-4（98.51 U/L），F(xiàn)2-24（76.93 U/L），F(xiàn)2-16（62.72U/L）和HX-13（47.95 U/L）。

2.3 酵母菌株的鑒定

圖3 酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of yeast strains in WL medium

圖4 基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the yeast with high yield β-glucosidase based on the sequence of 26S rDNA D1/D2 domain

由圖4可知，941株酵母菌被鑒定為14個種，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）334株，異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）324株，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）201株，美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）39株，淺白隱球酵母酵母（Cryptococcus albidus）26株，葡萄汁牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae）3株，仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniasporaopuntiae）3株，葡萄汁復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis vini）3株，陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）2株，庫德畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）2株，假絲酵母（Candida zemplinina）1株，核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）1株，季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）1株，膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）1株。

2.4 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力差異性分析

圖5 14種酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力的種間和種內(nèi)分布Fig.5 Interspecific and intraspecific distribution of 14 yeast strains with β-glycosidase-producing capacity

由圖5可知，100%的陸生伊薩酵母、核果梅奇酵母、季也蒙畢赤酵母、庫德畢赤酵母和膠紅酵母高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，結(jié)合表2的β-葡萄糖苷酶酶活力分析結(jié)果可知，初篩后得到的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株在酶活力上仍存在差異，最高酶活力為98.51 U/L，最低酶活力為10.07 U/L。美極梅奇酵母中高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的比例為48.7%、15.4%、20.5%和15.4%，異常威克漢姆酵母中高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的比例為46.8%、22.2%、15.2%和15.8%，釀酒酵母中高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的比例為1.5%、4.0%、32.8%和61.7%，葡萄汁有孢漢遜酵母中高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的比例為1.2%、1.2%、33.2%和64.4%，葡萄汁牙棒孢酵母中高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的比例為0、33.3%、33.3%和33.3%，100.0%的假絲酵母和仙人掌有孢漢遜酵母低產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，葡萄汁復(fù)膜孢酵母中高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的比例為0、0、33.3%和66.7%，淺白隱球酵母中高產(chǎn)、中產(chǎn)、低產(chǎn)和不產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的比例為0、0、26.9%和73.1%。

按照產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力將酵母菌的14個種分為3類：陸生伊薩酵母、核果梅奇酵母、季也蒙畢赤酵母、庫德畢赤酵母和膠紅酵母中全部的（100%）酵母菌β-葡萄糖苷酶酶活力高；美極梅奇酵母和異常威克漢姆酵母中β-葡萄糖苷酶酶活力高的酵母菌占每個種總數(shù)的50%左右；釀酒酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、葡萄汁牙棒孢酵母、假絲酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、葡萄汁復(fù)膜孢酵母和淺白隱球酵母中β-葡萄糖苷酶酶活力高的酵母菌數(shù)量很少，且含量均小于每個種總數(shù)的2%。結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶廣泛分布于已鑒定酵母菌的14個種，但產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力表現(xiàn)出較大的種間和種內(nèi)差異性。

3 結(jié)論

本研究通過七葉靈顯色法和p-NPG法對從寧夏賀蘭山東麓分離的941株野生酵母的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力進(jìn)行初篩和復(fù)篩，并且通過WL瓊脂培養(yǎng)基上的酵母菌落形態(tài)和26S rDNA D1/D2區(qū)的序列分析對所有酵母菌株進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果表明，941株酵母菌被鑒定為14個種，分別為：葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum），異常維克漢姆酵母（W.anomalus），釀酒酵母（S.cerevisiae），美極梅奇酵母（M.pulcherrima），淺白隱球酵母（C.albidus），葡萄汁牙棒孢酵母（C.lusitaniae），仙人掌有孢漢遜酵母（H.opuntiae），葡萄汁復(fù)膜孢酵母（S.vini），陸生伊薩酵母（I.terricola），庫德畢赤酵母（P.kudriavzevii），假絲酵母（C.zemplinina），核果梅奇酵母（M.fructicola），季也蒙畢赤酵母（P.guilliermondii）和膠紅酵母（R.mucilaginosa）。篩選出4株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌：SLY-4（98.51 U/L）、F2-24（76.93 U/L）、F2-16（62.72 U/L）和HX-13（47.95 U/L）。

通過對酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力進(jìn)行分類統(tǒng)計，分析酵母產(chǎn)酶能力的差異性，得出：β-葡萄糖苷酶廣泛分布于已鑒定酵母菌的14個種，但產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力表現(xiàn)出較大的種間和種內(nèi)差異性。其中，陸生伊薩酵母、核果梅奇酵母、季也蒙畢赤酵母、庫德畢赤酵母和膠紅酵母表現(xiàn)出較高的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶能力。本研究將為后續(xù)篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌提供借鑒，以達(dá)到改善果酒風(fēng)味的目的。

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