云南獨蒜蘭×陳氏獨蒜蘭種子萌發與幼苗生長研究

江鳴濤， 張藝祎， 李云霞， 黃繼芬， 吳沙沙

(1.福建農林大學園林學院，福建福州 350002； 2.福建農林大學海峽蘭花保育中心，福建福州 350002)

獨蒜蘭屬(Pleione)是蘭科植物中具有較高觀賞價值的一個屬[1]，該屬植物花色鮮艷、花型奇特，深受歐美和日本人士的喜愛，具有極高的園藝價值。在歐洲、美國、日本等地已廣泛栽培應用，在英國已規模化生產[2]，并已培育出約2 000個品種[3]。我國臺灣省每年外銷到日本的臺灣獨蒜蘭種球即可達20萬球[4]。獨蒜蘭屬約26種，我國有23種，其中12種為我國特有，是獨蒜蘭屬植物的分布中心，資源眾多[1]。但由于其栽培環境條件要求較高，開發利用滯后，我國目前僅中國科學院昆明植物研究所培育出2個新品種[5]，臺灣大學培育出少量幾個品種[6]。因此加快我國獨蒜蘭屬植物種質資源的保護和育種開發具有重要意義。

獨蒜蘭屬植物因其分球和頂球繁殖率低，無菌播種和假鱗莖作為外植體器官發生成苗速度快，但養成開花球時間長、成本高而嚴重制約其規模化生產[6]，種子無菌播種繁殖在新品種培育過程中具有重要意義。同時，與蘭科其他種一樣，獨蒜蘭屬植物的種子由于自身不透水、不透氣等原因，自然狀態下萌發率極低[7-8]，利用無菌播種組織培養技術能夠快速、大量繁殖。

云南獨蒜蘭(P.yunnanensis)具有重要的藥用價值[9]，且其花淡紫、粉紅或近白色，唇瓣具紫或深紅色斑[10]；陳氏獨蒜蘭(P.chunii)原產于中國云南西部和廣東北部，花大，淡粉紅色至玫瑰紫色，色澤通常向基部變淺，唇瓣中央具1條黃色或橘黃色條紋和多數同樣色澤的流蘇狀毛[1]，深受人們的喜愛，具有較高園藝觀賞價值。二者進行雜交，可能培育出花色豐富、唇瓣色彩和結構多變的新品種，因此有必要對其雜交種進行無菌播種研究。

本研究以云南獨蒜蘭為母本、陳氏獨蒜蘭為父本雜交的成熟未開裂蒴果為試驗材料，以花寶2號作為基本培養基探討不同濃度細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)和生長素α-萘乙酸(α-naphthalene acetic acid，NAA)對該雜交種無菌萌發和幼苗生長的影響，以期得到適宜的無菌萌發和幼苗生長培養基配方，從而為今后獨蒜蘭雜交種快速繁殖和新品種培育提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以人工授粉120 d的云南獨蒜蘭×陳氏獨蒜蘭雜交種的成熟未開裂蒴果作為種子萌發試驗材料。以經過90 d無菌培養得到的云南獨蒜蘭×陳氏獨蒜蘭雜交小苗作為繼代培養材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅菌及無菌播種 將采收的雜交果實放在自來水下沖洗30 min后轉入超凈工作臺，用75%乙醇表面消毒30 s，然后用0.15% HgCl2溶液浸泡30 min，最后用無菌水漂洗3次。將消毒后的果實平放在經滅菌的濾紙上，吸干水分后，用解剖刀將莢果縱向切開，將種子均勻播種到培養基表面，輕輕搖晃培養瓶使種子均勻分散。

1.2.2 原球莖誘導 雜交種萌發基礎培養基為3 g/L花寶2號+20 g/L蔗糖+2 g/L蛋白胨+50 g/L香蕉+50 g/L馬鈴薯+2 g/L活性炭+7 g/L瓊脂(pH值5.6)，探討6-BA和NAA這2個因素不同濃度配比對種子萌發的影響，按表1進行9組處理，每組接種10瓶，3次重復。于2015年12月27日配制培養基并接種，黑暗培養，至種子明顯膨大后轉至光照度為1 500 lx的日光燈下進行培養，培養溫度為(25±2) ℃，平均光照時間為12 h/d。培養90 d后統計原球莖分化率和植株平均高度。

表1 種子萌發培養基配方設計

1.2.3 幼苗培養 幼苗培養的基礎培養基配方為1 g/L蛋白胨+25 g/L蔗糖+1 g/L活性炭+7 g/L瓊脂(pH值5.6)，以6-BA、NAA和花寶2號3個不同濃度(表2)進行3因素3水平正交試驗設計，共9組。每組接種5瓶，每瓶轉接3叢大小接近的無菌萌發培養90 d的小苗，3次重復。于2016年3月28日配制幼苗培養基并轉接。培養60 d后統計原球莖平均直徑和植株平均高度。培養條件與無菌播種萌發后光照培養條件相同。

表2 幼苗培養基配方正交試驗設計

1.3 測定指標及數據分析

無菌播種培養90 d后，從每組處理中隨機挑選出3瓶，分別用鑷子夾出原球莖放在培養皿中，在體視顯微鏡(Nikon，SMZ18，日本)下觀察9個不同視野，以葉片突破原球莖的植株視為分化成功，以葉片突破原球莖的植株數/視野中原球莖總數×100%作為原球莖分化率。在體視顯微鏡下拍照，于AutoCAD 2007中測量植株高度。

植株在幼苗培養培養基中培養60 d后，每組處理隨機選取3瓶，隨機選出10株植株，置于坐標紙上拍照(圖1)，于CAD軟件中測量植株高度和原球莖直徑。

用Excel 2007進行數據整理，采用SPSS 19.0軟件(IBM，美國)的Duncan’s方差分析法進行數據的顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 無菌萌發形成原球莖

2.1.1 種子無菌萌發過程 種子無菌播種在黑暗條件下培養20 d時開始膨大，后轉至光照條件下繼續培養，種子開始形成一些淡黃色小突起，即為原球莖開始形成。隨著時間的推移，顏色開始由淡黃色變成淺綠色，原球莖分化逐漸形成。培養90 d后，可觀察到萌發的種子已經形成極小的原球莖，部分原球莖長出幼嫩葉片(圖1)，且根部有白色絨毛。

2.1.2 原球莖分化及株高的差異 9組處理原球莖分化率分為3個水平，處理6和處理9的原球莖分化率水平顯著高于其他組，其中處理6原球莖分化率高達94.45%，處理9分化率為87.19%；處理1、處理2、處理3、處理5和處理8分化率水平居中，在53.92%～63.38%之間；處理4和處理7原球莖分化率顯著低于其他組合(圖1-D、圖1-G)，分化率分別為37.58%和29.75%(表3)。

另外，植株平均高度差異分為6個水平，處理6植株平均高度顯著高于其他組，達到1.56 cm(圖1-F)；處理3(圖1-C)和處理9(圖1-I)次之，植株平均高度分別為1.15 cm和1.21 cm；植株平均高度最低的為第7組，僅為0.22 cm(表3)。

表3 種子無菌萌發情況統計

注：同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表4同。

2.2 幼苗生長

2.2.1 原球莖直徑的差異 雜交子代原球莖在不同濃度花寶2號添加6-BA和NAA不同配比的培養基中培養60 d后，植株發育成具1～2張葉片的小苗，植株高度和原球莖直徑均有不同程度的增加。處理1假鱗莖膨大顯著大于其他處理，且植株生長健壯。處理6、處理8和處理9次之，假鱗莖膨大后直徑均約0.3 cm；處理5中原球莖直徑最小，僅為0.14 cm(表4)，且出現部分植株褐化后停止生長的現象。3個研究因素對于假鱗莖膨大的R值排序為花寶2號(0.153)>NAA(0.092)>6-BA(0.043)，表明花寶2號對該獨蒜蘭雜交種假鱗莖膨大促進作用最強，NAA次之，6-BA作用最弱。

2.2.2 平均株高的差異 處理8植株平均高度顯著高于其他組，達到4.38 cm(表4)， 這與原球莖誘導培養基中植株高度最高的處理6中的激素含量相同，說明1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于葉片生長。處理1、處理2、處理6和處理9次之，植株平均高度均小于3 cm；處理4中植株平均高度值最低，僅為1.35 cm(表4)，但該處理中植株高度整齊一致，有利于后期統一出瓶和管理。對于幼苗平均株高而言，3個因素的R值排序為NAA(1.70)>花寶2號(1.51)>6-BA(0.43)，表明NAA對于植株的促進作用最強，花寶2號次之，6-BA最弱。

表4 不同添加物處理對雜交種幼苗生長的影響

3 討論與結論

3.1 激素對原球莖分化率及株高的影響

在沒有外源添加6-BA和NAA的培養基中，原球莖分化率即可達到50%以上，在此基礎上添加6-BA(0.5 mg/L或 1.0 mg/L)，原球莖誘導率降低，說明單獨添加6-BA具有抑制原球莖分化的作用。當培養基中僅添加NAA(0.5 mg/L 或 1.0 mg/L)時，對原球莖分化促進作用不明顯，與不添加NAA對原球莖分化率沒有差異。當NAA濃度達到1.0 mg/L時，添加低濃度6-BA(0.5 mg/L或1.0 mg/L)對原球莖誘導具有明顯的促進作用。表明細胞分裂素6-BA和生長素NAA共同作用對該雜交種種子萌發形成原球莖具有明顯促進作用。

黃家林等研究云南獨蒜蘭(P.yunnanensis)種子無菌萌發發現，僅添加細胞分裂素6-BA或KT對其萌發具有抑制作用[11]，本研究結果與之相同。同樣，對云南獨蒜蘭無菌萌發研究發現，單獨添加6-BA具有抑制作用，單獨添加NAA對種子萌發具有一定的促進作用[12]，本研究結果與之相同；而B5培養基+0.25 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA同樣具有抑制種子萌發的作用[13]，本研究結果與之不同，但本研究陳氏獨蒜蘭種子萌發結果與之一致，說明激素對于不同種質種子萌發的作用存在差異。

當6-BA濃度為0 mg/L時，NAA對種子萌發后植株高度具有促進作用，隨著NAA濃度的增加，植株高度明顯增高。當不添加NAA時，隨著6-BA濃度的增加，植株高度呈現降低的趨勢，說明6-BA對于植株高度具有抑制作用。雖然在此階段植物葉片的生長對于后期假鱗莖的形成具有重要作用，但是由于該培養階段重點關注的是原球莖的分化，所以現有的研究報道對平均株高指標關注不多。

綜合種子萌發過程中原球莖分化率和植株高度2個指標，處理6為所有處理中最佳，即3 g/L花寶2號+0.5 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+20 g/L蔗糖+50 g/L 馬鈴薯+50 g/L香蕉+2 g/L蛋白胨+2 g/L活性炭+7 g/L瓊脂為種子無菌萌發最佳培養基。

3.2 花寶2號和激素對幼苗生長的影響

已有的研究報道，多是在原球莖誘導后進行增殖培養方面，缺少專門針對假鱗莖膨大培養健壯植株的過程[12-14]，陳之林等研究白花獨蒜蘭(P.albiflora)原球莖誘導出來后接種到2 g/L花寶2號+0.5 mg/L NAA+100 ml/L香蕉勻漿+2 g/L 活性炭培養基上培養60 d假鱗莖直徑可達5 mm[15]。疣鞘獨蒜蘭(P.praecox)和巖生獨蒜蘭(P.saxicola)原球莖在1/2 MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA培養60 d后可長為高2～5 cm、假鱗莖直徑5 mm的植株[16]。對臺灣獨蒜蘭無菌播種假鱗莖膨大研究表明，MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+100 g/L馬鈴薯有利于假鱗莖膨大，培養 90 d 后假鱗莖直徑可達0.33 cm[17]，略小于本研究培養60 d所得到的0.36 cm的結果。

從研究的結果可知，花寶2號對該雜交種原球莖膨大有著明顯的促進作用，NAA對幼苗葉片生長具有明顯的促進作用，綜合植株膨大和植株平均高度2個指標，適合該雜交種幼苗生長的培養基為1 g/L花寶2號+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+1 g/L蛋白胨+25 g/L糖+1 g/L活性炭+7 g/L 瓊脂。

已有的研究報道表明，獨蒜蘭屬植物組培生根相對容易。此外，在前期的研究中發現，組培苗生根與否對于煉苗移栽的影響不大，假鱗莖的大小對于移栽成活和后期植株生長的作用更重要(未發表)，故本研究沒有專門針對生根進行研究。由于組培苗移栽后真正生長成為新植株的為假鱗莖基部的芽，而芽的生長初期營養主要來自已有的假鱗莖，所以組培苗培養中假鱗莖膨大是重點要解決的問題，尤其是針對縮短膨大時間和提高膨大效率方面值得進一步深入研究。

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