水楊酸對四棱石斛試管苗生長及多糖合成的影響

陳小強， 李 弈， 王景太， 朱立媛， 肖麗君， 孫 寧， 王東元， 覃美運

(天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384)

四棱石斛(Dendrobiumtetragonum)屬蘭科石斛屬，具有重要觀賞價值和藥用價值[1]。近幾年來，隨著藥用石斛開發利用的不斷深入和國內外需求量的逐年增加，我國野生四棱石斛資源遭到了嚴重破壞。在自然條件下四棱石斛能傳粉結果，但結果率很低；能進行種子繁殖和營養繁殖，但繁殖速率低下，自然更新能力差。人工授粉可以大大提高多數石斛的結果率，但操作上費時費力；而植物組織培養技術可以在短時間內大批量地培育出所需要的植物新個體，還可以防止植物病毒的危害，極大地提高了農業生產效率，對于四棱石斛野生資源的保護和擴大栽培及其綜合利用具有極其重要的意義。

四棱石斛是傳統名貴中藥材且為上品，經過國內外學者幾十年來對石斛的藥理研究，發現石斛中主要的藥用成分是生物堿和多糖[2]。其中，多糖屬于活性多糖的一種，是石斛的主要次生代謝產物，具有降血糖、抗腫瘤、免疫調節、抗氧化等多種功能[3]。

顧慧芬等的研究表明，鐵皮石斛組培苗和野生品多糖類型和含量基本相同[4]。高建平等研究報道，鐵皮石斛組織培養物原球莖具有促進模型鼠體內淋巴細胞轉化的作用且其作用與原藥材相似[5]。這些研究都表明，以組織培養物代替原植物作藥用是可行的。

水楊酸(salicylic acid，簡稱SA)是一種重要的能夠激活植物過敏反應和系統獲得性抗性的內源信號分子，能夠促進與植物防衛反應有關的次級代謝產物的高水平合成[6]。有試驗表明，水楊酸對離子吸收、膜的通透性以及一些重要代謝過程起調控作用，可以促進玉米胞內可溶性糖向多糖轉化，增加胞內多糖的含量[7]。王博等的試驗結果表明，隨著水楊酸濃度的增加，霍山石斛類原球莖生長受到一定程度的抑制，多糖的合成也表現出先增加后降低的現象，說明水楊酸促進多糖的合成有一個適合的作用濃度[8]。

本研究以四棱石斛試管苗為材料，通過植物組織培養技術研究不同濃度水楊酸在一定的激素[6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)]濃度水平調節下對四棱石斛類試管苗生長、多糖合成的影響，旨在獲得適合四棱石斛生長且促進多糖合成的水楊酸與激素濃度的最佳配比方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

四棱石斛試管苗，由天津農學院植物細胞工程研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同種類及濃度的植物激素對四棱石斛試管苗生長的影響 利用植物組織培養技術對四棱石斛試管苗進行擴繁，利用雙因素法選擇初步培養試管苗的培養基配方為MS+6-BA+NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭。將6-BA和NAA的濃度分別設為3個梯度，另設1組空白對照(均不添加6-BA、NAA)，共10組，每組5次重復，選擇最適合四棱石斛試管苗生長的培養基，四棱石斛試管苗增殖培養的激素配比見表1。

表1 四棱石斛試管苗增殖培養的激素配比

1.2.2 不同濃度水楊酸對四棱石斛試管苗生長的影響 選擇最適合四棱石斛試管苗生長的激素組合后，在此基礎上采用單因素法向培養基中加入3個濃度梯度的水楊酸(10、20、30 μmol/L)進行調節，另設1組空白對照(1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA)，共4組配比，依次編號為1、2、3、4，每組5次重復。根據四棱石斛試管苗生長的不同階段所測的多糖含量篩選出促進多糖生成的培養基配方。

1.2.3 四棱石斛試管苗多糖的提取及測定 多糖的測定采用苯酚-硫酸法[9]。根據李滿飛等的方法[10]進行改良，四棱石斛多糖的測定方案如下：精確稱取四棱石斛樣品2 g，研磨，放入燒杯中，量取20 mL蒸餾水加入其中，煮1 h，在離心機中于3 000 r/min離心5 min，收集上清液待用；將濾渣放入燒杯，再加入20 mL蒸餾水，進行二級提取1 h，之后離心收集上清液，并測量2次提取液的體積；吸取0.1 mL提取液于試管中，分別稀釋10、20、30倍，取1 mL稀釋液，加入1 mL 5%苯酚，搖勻，再精確加入5 mL濃硫酸，邊搖邊加入，冷卻至室溫。空白對照組為1 mL蒸餾水+1 mL苯酚+5 mL濃硫酸，用754型分光光度計在490 nm處測定其吸光度。

2 結果與分析

2.1 不同激素濃度配比下四棱石斛試管苗生長狀況的研究

在不同激素調節下，四棱石斛生長狀況見表2。2、3、4、5、6、8號培養基培養的試管苗生長明顯大于1 cm，適宜四棱石斛試管苗生長，其中，5號培養基的生長狀況最好，葉片繁密茂盛，優于其他組，詳見圖1、圖2。因此，可以確定最適合四棱石斛生長的激素濃度配比方案如下：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭。在接下來的水楊酸調節四棱石斛生長的試驗中將應用此組激素濃度配比方案。

表2 不同激素調節下四棱石斛試管苗的生長狀況

注：“+”代表長勢一般；“++”代表長勢良好；“+++”代表長勢優；“++++”代表長勢最好。表3同。

2.2 不同濃度水楊酸處理下四棱石斛生長狀況的研究

培養60 d內不同濃度水楊酸處理下四棱石斛試管苗的生長狀況見表3。培養15 d時試管苗生長情況無明顯變化，種苗矮小，葉色較淺，培養30 d時長勢較為明顯，種苗長高，培養 45 d 時試管苗長勢更好，其中第2組優于其他組，培養60 d時第2組試管苗長勢最好，葉色變為深綠色，生長狀況茂密繁多。第2組在培養60 d時四棱石斛試管苗的長勢見圖3。

2.3 水楊酸對四棱石斛試管苗多糖含量的影響

2.3.1 繪制標準曲線 采用標準葡萄糖，用苯酚-濃硫酸法測定其含量，如果測定數據不在測量范圍內，可以進行稀釋或者濃縮來調至測量范圍，測定的標準曲線為y=2.608 7x-0.000 6，r2=0.999 3(y表示吸光度；x表示濃度，μg/mL)，詳見圖4。

表3 不同水楊酸配比下四棱石斛的生長狀況

2.3.2 多糖含量測定結果 多糖含量=[上清液體積(mL)×稀釋倍數×多糖濃度(μg/mL)]/質量(mg)×100%。上清液體積為2次水提分離的體積總和；稀釋倍數分別為10、20、30，目的是使數據達到測量范圍。經過60 d的生長， 測量結果以稀釋10倍為準， 稀釋20、30 倍的數據不在測量范圍內，應舍棄。不同發育階段、 不同水楊酸濃度下四棱石斛試管苗多糖含量見表4。結果表明，經過60 d的培養處理，多糖含量達到最高值，水楊酸對四棱石斛多糖的合成具有促進作用，其中濃度為 20 μmol/L 的水楊酸促進作用最明顯。因此可知，最適宜試管苗生長并促進多糖合成的培養基是MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭+20 μmol/L水楊酸。

表4 不同水楊酸濃度下四棱石斛多糖含量

3 討論與結論

3.1 不同激素濃度對四棱石斛試管苗生長的影響

激素6-BA可以促進細胞分裂并且可以誘導芽的分化，而NAA則主要誘導植物細胞的分裂[11]。試管苗的分化和增殖不僅被單一激素的濃度所影響，還與激素種類、濃度配比有關，不同的NAA、6-BA濃度配比可以對石斛試管苗生長產生不同影響。過低濃度的NAA、6-BA并不能對植株的快繁產生明顯影響，而較高濃度的激素也會對植株的生長產生抑制作用。蔣向輝等采用正交試驗設計方法探討不同激素與濃度組合對鐵皮石斛愈傷誘導、芽分化與根誘導的影響，結果表明，合適的6-BA與NAA配比可誘導產生不定芽[12]。宋順等研究了激素對鐵皮石斛試管苗生長的影響，結果表明，當NAA ∶6-BA為1 ∶5時，鐵皮石斛分化率達80%[13]。本試驗也證明了這點，只有在適宜的濃度范圍內(1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA)，四棱石斛試管苗的快速繁殖才會產生最好的效果。在本研究中，最適合四棱石斛生長的激素濃度配比的方案為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+6.5 g/L瓊脂+20 g/L蔗糖+2 g/L活性炭。

3.2 不同濃度水楊酸對四棱石斛試管苗生長的影響

研究表明，水楊酸能夠在多種植物的抗非生物脅迫和抗病方面起作用[6]，但是水楊酸在對四棱石斛的調節方面的研究尚未見報道。王靜等以鐵皮石斛為材料，通過外施不同濃度的水楊酸，檢測其有關滲透調節物質、脯氨酸、葉綠素a、可溶性糖、葉綠素b和蛋白質含量，從而為選擇適宜濃度的水楊酸、從生理角度提高鐵皮石斛的產量提供理論依據[14]。本試驗結果顯示，水楊酸確實對四棱石斛試管苗的生長有促進作用，同期對照下分化苗更多，生長更茂密，這一研究結果可為四棱石斛大批量生產提供理論依據。

3.3 不同濃度水楊酸對四棱石斛試管苗多糖含量的影響

多糖類成分是石斛中具有抗腫瘤作用和促進免疫的成分。近年來，對于石斛屬次生代謝產物積累情況的研究，主要集中在通過改變培養條件去提高石斛次生代謝產物量。研究表明，誘導子濃度在一定范圍內對石斛類胞內多糖的合成具有顯著的促進作用[15]。水楊酸是一種特殊的生理生化信號，在石斛次生代謝過程中，能有選擇性、專一和快速地誘導一些特定基因的翻譯表達，從而調節細胞中代謝產物的合成[16]。也可能因為水楊酸還具有抗氧化的重要作用，充分為細胞提供良好的代謝環境，從而促進細胞多糖合成。王博等研究表明，水楊酸的濃度控制在50～150 μmol/L范圍內對細胞的生長沒有明顯影響，但是可以明顯促進多糖合成[8]。本試驗研究不同濃度水楊酸對四棱石斛試管苗多糖含量的調節作用，發現水楊酸濃度在20 μmol/L時，多糖含量達到最高值，這為擴大藥源和開發新藥提供了更多的理論依據。

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